Tecniche immunoanalitiche

Tecniche immunoanalitiche

L'Immunometria comprende tutte le tecniche che utilizzano una reazione Ab-Ag per misurare la concentrazione di un dato analita. Tra di esse alcune utilizzano isotopi radioattivi, altre utilizzano reazioni colorimetriche o reazioni enzimatiche. Il complessi Ab-Ag possono essere sia in fase liquida che su supporto; gli Ab, a loro volta, possono essere monoclonali o policlonali.

RIA - Dosaggio Radioimmunologico (Radio Immuno Assay)

È di largo impiego per il dosaggio di ormoni ed altre sostanze di interesse (ferritina, antigeni virali, CEA). La condizione essenziale è la disponibilità di un antigene identico a quello che si vuole misurare, marcato con un radioisotopo.

Questa tecnica si basa sulla competizione tra un antigene freddo ed una quantità limitante de corrispondente antigene marcato, per il legame con un numero limitato di siti anticorpali presenti in una quantità costante d'antisiero.

All'equilibrio, in presenza di un eccesso di antigene, ci saranno sia antigeni liberi che antigeni legati. La quantità di antigene marcato all'anticorpo diminuirà con l'aumento dell'antigene freddo nel campione.

Allestendo una curva di taratura, ponendo in ascissa quantità note e crescenti dell'antigene da dosare ed in ordinata il segnale radioattivo, dato il complesso Ab-Ag, sarà possibile risalire alle concentrazioni incognite dell'analita nei vari liquidi biologici.

All'aumentare della concentrazione dell'analita diminuirà la radioattività del complesso, essendo la quantità dell'antigene da dosare crescente e la quantità di antigene marcato e di anticorpo uguale in tutte le prove.

Vantaggi:

Uso di immunogeni puri.

Sensibilità alta (pg).

Specificità

Automatizzabile.

Svantaggi:

Costi.

Deperibilità dei radioattivi.

Rischio.

Personale specializzato.

Negli antigeni proteici il gruppo fenolico di un residuo di tirosina  marcato con ¹²⁵I; gli apteni non proteici sono normalmente marcati con ³H⁺.

IRMA - Dosaggio Immuno-Radiometrico (Immuno-Radiometric-Assay)

Prevede l'utilizzo di antisieri marcati che reagiranno con il campione fino a marcare tutto l'antigene. Il conteggio della radioattività determinerà la misura diretta dell'antigene presente. È, questa, la principale differenza con RIA, perché in questo caso la proporzionalità diretta tra radioattività e concentrazione di antigeni è diretta, mentre nel RIA è inverse ed è un procedimento che si basa sulla competizione.

Si effettua il dosaggio diretto degli anticorpi marcati. Il vantaggio sta nelle facilità, nel minore rischio e nella maggiore specificità (10^-15).

Immunoprecipitazione

Un anticorpo diretto contro un antigene proteico è usato per isolare l'antigene specifico da una miscela. L'anticorpo è legato ad una matrice insolubile. L'antigene purificato è distaccato dall'Ab mediante cambiamenti di pH ed analizzato con elettroforesi in gel di poliacrilamide.

ImmunoBlot (Western Blot)

Serve per calcolare la quantità relativa ed il peso molecolare di una proteina contenuta in una miscela di proteine.

L'antigene è sottoposto a separazione elettroforetica dagli altri. Le proteine sono trasferite (blotting) dal gel su una membrana di nitrocellulosa. La posizione dell'antigene sulla membrana è visualizzata mediante legame di un anticorpo radiomarcato o coniugato con un enzima mediante una reazione con un substrato cromogeno specifico.

Immunofluorescenza (FIA)

La sensibilità di questa tecnica è nell'ordine di 10^-8. Con adatti procedimenti è possibile coniugare gli anticorpi di un siero con alcune sostanze fluorescenti, come l'isotiocianato di fluoresceina.

Diretta: Ab fluorescenti a contatto diretto con l'antigene e illuminazione del preparato con UV.

Indiretta: antigene con il siero immune o presunto tale. Sopo incubazione si aggiunge un siero contenente Ab anti-Ig e poi si procede all'illuminazinoe con UV.

Immunoluminescenza (LIA)

L'illuminescenza è il fenomeno di emissione di luce da una molecola in seguito al passaggio da uno stato elettronico eccitato allo stato fondamentale. Questo procedimento è legato al reazioni esoergoniche, che cedono energia al sistema, come l'incubazione del composto adatto con H₂O₂.

La sensibilità è paragonabile a quella del RIA, ma la specificità risulta inferiore.

Tecniche Immunoenzimatiche

Queste tecniche sfruttano la possibilità di coniugare anticorpi con alcuni enzimi; il legame enzima-Ab è svelato agiungendo il substrato ed i reattivi necessari per la reazione catalizzata; il prodotto terminale deve essere colorato e la sua concentrazione è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'analita.

ELISA - Dosaggio Immuno Assorbente Legato all'Enzima (Enzima-linked Immuno-sorbent Assay)

Le reazioni sono eseguite in pozzetti, al cui interno vengono fatti aderire antigeni o anticorpi noto. Vanno inseriti, poi, gli analiti e dopo i lavaggi necessari, i complessi Ab-enzima. La positività della reazione dell'enzima al substrato si appalesa per la comparsa di un prodotto di reazione colorato, quantizzato mediante spettrofotometria.

Il metodo così descritto è il più utilizzato, definito Sandwich.

L'ELISA è molto specifico, ma la sensibilità è legata alla densità ottica, per cui non è molto alta, inferiore a quella del RIA, nell'ordine di 10^-6 (pg).