Tecniche cromatografiche

La cromatografia è una tecnica per la separazione dei componenti di una miscela, sulla base de diversi principi, quali le differenti fasi, la carica elettrica, le dimensioni molecolari. A seconda che il componente sia disciolto in fase liquida o allo stato gassoso, si parla di cromatografia liquida o di gas-cromatografia.

Lo studio delle proteine avviene mediante la separazione da moecole molto piccole con la dialisi, attraverso una membrana semipermeabile, come una membrana porosa di cellulosa.

Cromatogradia per filtrazione su gel - gel cromatografia

Si ottengono separazioni nette in base alle dimensioni.

Il campione è applicato su una colonna che consiste di granuli porosi di un polimero insolubile, altamente idratato, come Destrano o Agarosio o la Poliacrilamide. [1]

Questi granuli hanno, in genere, un diametro di 100 mm (0,1 mm). le molecole più piccole possono entrare nei granuli. Il risultato è che le molecole più piccole si distribuiscono nella soluzione acquosa sia all'interno dei granuli che intorno ad essi, mentre le molecolr più grandi passano rapidamente attraverso la colonnae e ne escono prima. L'ordine in cui le molecole escono è inverso a quello dell'elettroforesi in gel, in cui una struttura polimerica continua impedisce il movimento delle molecole più grandi.

Cromatografia a scambio ionico

Le proteine si separano in base alla carica netta, utilizzando questa tecnica. Se una proteina ha una carica netta positiva a pH7, si attaccherà in genere ad una colinna di granuli che contengono gruppi carbossilici, mentre una proteina con carica negativa non avrà interazione.

Cariche negativamente: colonne di DEAE, Dietil-amio-etil-cellulosa.

Cariche positivamente: colonne di CM cellulosa, Carbossi-metil-cellulosa.

Cromatografia per affinità

È un altro metodo per purificare le proteine per gruppi chimici specifici.

Per esempio la Concanavalina A si attaccherà a colonne di granuli contenenti residui di glucosio, per la presenza di residui affini.

Cromatografia liquida ad alta risoluzione ed automazione della cromatografia (HPLC = high performance liquid cromatography)

Si tratta di una tecnica basata su un apparecchio che fa circolare il liquido in esame a pressione discreta in un sistema cromatografico chiuso. Con questo macchinario si possono misurare componenti a basse concentrazion, senza necessità di purificazione o preventiva separazione. Esempi:

Hb-glicosata: glicemia e diabete.

Hb A₂ b-talassemia eterozigotica.

Catecolammine: ipertensione, feocromocitoma.

Cataboliti del collagene: osteoporosi.