La cromatografia

LA CROMATOGRAFIA

Come la distillazione, anche la cromatografia è una tecnica di separazione che permette di separare i componenti di 1 miscela, che si ripartiscono in maniera diversa in 2 fasi, in funzione della loro affinità con esse. Una delle 2 fasi viene immobilizzata, e perciò è detta fase stazionaria, mentre l'altra fase, la fase mobile, viene fatta scorrere in modo continuo sulla fase stazionaria. Se, ad esempio quella fissa è dentro una colonna, quella mobile attraversa la colonna. Tuttavia possiamo classificare la cromatografia in base a diversi criteri:

In base al meccanismo di separazione:

a)     Per adsorbimento;

b)     Per ripartizione;

c)     Scambio ionico;

d)     Esclusione molecolare.

In base alla fase mobile:

a)     Se è liquida avremo LC (Cromatografia liquida);

b)     Se è gassosa avremo GC (Gascromatografia).

In base alla polarità delle 2 fasi:

a)     Se la fase stazionaria è polare (come H₂O o gel di silice) e la fase mobile è apolare (esano) avremo la cromatografia in fase normale;

b)     Se la fase stazionaria è apolare e la fase mobile è polare avremo la cromatografia in fase inversa.

In base alla tecnica:

a)     Cromatografia su colonna;

b)     Cromatografia su strato sottile (TLC);

c)     Cromatografia a scambio ionico (IEC).

Tutte le separazioni cromatografiche si concludono con la registrazione del cromatogramma, cioè il tracciato che descrive l'andamento del segnale del rivelatore in funzione del tempo di eluente. Il tracciato prende il nome di picco cromatografico. In condizioni ideali, il picco ha la forma perfettamente simmetrica di una curva gaussiana, e ciò è dovuto al processo di dispersione che la sostanza subisce quando scorre nella colonna.

segnale

t

I parametri del picco cromatografico sono:

L'altezza del picco (h) che è la distanza tra il punto di massimo e la tangente alla linea di base;

La larghezza (o ampiezza) del picco:

a)     Ampiezza alla base del picco (W_b);

b)     Ampiezza a metà altezza (W_h), misurata al 50% dell'altezza.

L'area totale sottesa alla curva del picco che è proporzionale alla concentrazione di sostanza separata e viene usata come parametro nell'analisi quantitativa;

Il tempo di ritenzione (t_r) che è il tempo impiegato da ogni sostanza per scorrere sulla fase stazionaria. Il t_r di una sostanza che non viene trattenuta dalla fase stazionaria è detto tempo morto (t_rM) ed è il caso di un picco molto piccolo che si trova a sinistra nel cromatogramma e che indica proprio una sostanza che non viene trattenuta dalla fase stazionaria, venendo trascinata via dall'eluente. Il tempo speso da ogni sostanza eluita nelle interazioni chimico-fisiche con la fase stazionaria è detto tempo di ritenzione netto (t_r^') ed è il risultato tra la differenza tra t_r e t_rM.

Una tra le più semplici tecniche di separazione cromatografiche è la TLC, cioè la cromatografia su strato sottile (Thin Layer Chromatography). Questa è una particolare tecnica cromatografica in cui la fase stazionaria è immobilizzata, sotto forma di strato sottile, su una superficie piana, lungo la quale viene fatta correre la fase mobile. La fase stazionaria è generalmente uno strato dallo spessore uniforme di circa 1 mm di materiale adsorbente, depositato su una lastrina (o placca). Il materiale adsorbente può essere gel di silice allumina o cellulosa in polvere. La fase mobile è un solvente opportunamente scelto (o una miscela di solventi), capace di separare i componenti della miscela da analizzare e poco affine per polarità alla fase stazionaria scelta. Proprio riguardo alla polarità della fase stazionaria, avremo i vari meccanismi di adsorbimento per la cromatografia in fase normale, mentre meccanismi di ripartizione per la cromatografia in fase inversa. La TLC è una tecnica molto veloce poiché consente di effettuare separazioni in tempi che vanno da una decina di minuti a 1-2 ore.

Secondo la procedura più diffusa, si deposita una piccola macchia della miscela da separare alla base dello strato (a circa 1 cm) con una matita di grafite e poi si immerge parzialmente la lastrina di vetro (preparata col materiale adsorbente) nell'eluente, scelto in modo opportuno. Il contenitore viene chiuso in modo da mantenere l'ambiente saturo di vapori di solvente. L'eluente sale lungo lo strato per capillarità e trascina in modo differenziato i vari componenti della miscela, separandoli,  per cui si formano macchie di varie dimensioni, più o meno separate fra loro, distribuite lungo lo strato. Questo processo, per cui la miscela si suddivide nei diversi componenti, è detto sviluppo. Se la separazione non è stata sufficiente, si può ricorrere ad una separazione bidimensionale, fatta cioè con 2 diversi solventi, e la lastrina usata viene posta nei 2 solventi rispettivamente in 2 direzioni. Qualora non sia possibile osservare direttamente le macchie di campione sulla superficie della lastrina si può ricorrere all'osservazione sotto luce ultravioletta

La qualità delle prestazioni della TLC viene espressa per mezzo di alcuni parametri:

La selettività: E' la capacità del sistema di fornire macchie ben distanti le une dalle altre. Questo parametro dipende dalla corsa relativa dei diversi componenti della miscela, che viene misurata dal fattore di ritenzione o di ritardo assoluto(R_F)

R_F =

in cui d_i è la distanza percorsa sulla lastra dal componente della miscela, mentre d_el è la

distanza percorsa dall'eluente.

A volte si fa riferimento alla distanza percorsa sulla lastra da una specie chimica,   presente nella miscela, scelta come standard di riferimento, in questo caso il fattore di ritardo relativo è legato dalla relazione:

R_F

in cui d_st è la distanza percorsa sulla lastra dello standard di riferimento; R_Fi è il fattore di ritardo del componente, e R_Fst è il fattore di ritardo dello standard.        

L'efficienza esprime la capacità del sistema di mantenere compatta la macchia fino al termine dell'eluizione. In TLC l'allargamento delle macchie dipende sostanzialmente solo dalla diffusione molecolare, che avviene in tutte le direzioni nel corso dell'eluizione; per questo si ottengono macchie tanto più grandi, quanto più lunga è la loro corsa sulla fase stazionaria. Il concetto di piatto teorico (ricavato dal'analogia tra una colona di distillazione a piatti e una separazione cromatografica su colonna) può essere usato anche per la TLC. E' usata infatti l'equazione che fornisce il numero dei piatti teorici (N) in TLC:

N =

Quindi, tanto è maggiore il numero dei piatti teorici, tanto più compatta risulta la macchia al termine della corsa dell'eluente.

La risoluzione esprime la capacità del sistema si fornire macchie ben distanziate tra di loro alla fine dell'eluizione. La risoluzione (R_s) fra 2 macchie dipende sia dalla selettività sia dall'efficienza del sistema cromatografico. Essa viene definita con la relazione:

R_s

in cui d è la distanza tra i centri delle 2 macchie; w_A e w_B il diametro di ciascuna macchia, misurato lungo la direzione della corsa dell'eluente. Le due macchie si considerano risolte se R_s è maggiore di 1.

La capacità è la quantità massima di campione che può essere depositata alla base dello strato. Infatti, se si supera la capacità, si ottengono deformazioni delle macchie di vario genere.

I materiali che costituiscono la fase stazionaria solida sono quasi sempre vetro (lastrine con spessore 1-2 mm e di dimensioni 20x20,10x20,5x20 cm), alluminio, plastica o tessuto di microfibre di vetro. La fase stazionaria può essere sia solida sia liquida. Quelle solide più utilizzate sono gel di silice (polimero dell'acido orto silicico H₄SiO₄), allumina, o cellulosa; esse devono essere fatte aderire saldamente al sostegno. Quelle liquide più usate sono idrocarburi, oli minerali oli e grassi vegetali. Per la scelta dell'eluente(fase mobile) in TLC è importante la polarità. Esempi possono essere il pentano, il cloroformio, il benzene e cosi via. Essa viene scelta in base alla natura delle sostanze che bisogna separare.