Sumoilazione di Xbh1

Sumoilazione di Xbh1

In uno screening col saggio di doppio ibrido, è stato isolato come possibile interattore della proteina Xbh1 il prodotto del gene SUMO 1. L isolamento di SUMO 1 col doppio ibrido riflette probabilmente il fatto che Xbh1 è soggetta a sumoilazione. La sumoilazione consiste nella formazione di un legame covalente tra specifici residui di lisina di una proteina e la proteina Sumo. Sumo è una proteina presente in tutti gli eucarioti; nei mammiferi si conoscono 4 geni codificanti per forme diverse di questa proteina: Sumo 1, Sumo 2, Sumo 3 e Sumo 4, ma solo dei primi tre si è isolato il prodotto proteico.

Per quanto riguarda X laevis si è trovato in banca dati sequenze annotate corrispondenti a Sumo 1 e Sumo 2 e diverse EST con un alto grado di omologia con Sumo 3.

Il nome Sumo è un acronimo di small ubiquitin related modifier, dato che questo polipeptide assomiglia all ubiquitina nella struttura tridimensionale e per il macchinario composto da tre enzimi che consentono la formazione del legame covalente, o isopeptidico, con il gruppo -amminico di residui di lisina.

La sequenza consensus riconosciuta, più frequentemente, dall apparato di sumoilazione è YKXE dove: con Y si intende un aminoacido con un residuo idrofobico ingombrante, ad esempio prolina; con K un residuo di lisina, a cui si attacca Sumo; con X un aminoacido qualunque; con E un residuo di acido glutammico.

Tuttavia questa sequenza è frequente in molte proteine non sumoilate ed inoltre è stato rilevato che Sumo si può legare a lisine non appartenenti a questo consensus.

A differenza dell ubiquitina, Sumo ha una tendenza minore a formare catene mentre

le catene di 4 o più residui di ubiquitina sono un forte segnale di degradazione proteica .

La sumoilazione può avere diversi effetti sulla struttura della proteina che ne è soggetta Fig. 1 4 :

- Può bloccare un sito di attacco per un altra proteina, in particolare competere con l ubiquitina preservando la proteina dalla degradazione

- Può creare un nuovo sito di legame

- Può indurre un cambiamento nella forma della proteina

Da questi cambiamenti nella struttura possono dipendere cambiamenti nella funzione e nella localizzazione della proteina sumoilata.

Fig. 1 4 - Possibili conseguenze delle interazioni di Sumo con una proteina. Da Gill 2003.

Risultati sperimentali indicano che in C. elegans la sumoilazione della proteina SOP è necessaria per la sua localizzazione nucleare e per la sua azione di repressore di geni Hox Zhang et al , 2004 , così come è necessaria all attività trascrizionale di p 3 in Drosophila e quindi alla sua attività proapoptotica Mauri et al. 2007 .

Dati recenti ( Terada et al. 2010) indicano come la sumoilazione regoli la proliferazione dei progenitori retinici in Xenopus laevis impedendone l uscita dal ciclo cellulare.

Nel caso specifico di Xbh1 si è ipotizzato che la sumoilazione possa essere necessaria per la sua attività biologica; in particolare è stato dimostrato che la mutagenesi sui due siti canonici di sumoilazione PKLE di Xbh1 v. sotto) impedisce la sua attività di specificatore di cellule gangliari nella retina di X. laevis nostri dati non pubblicati . Dall analisi con il programma SUMO plot è emerso che la sequenza proteica di Xbh1 presenta due siti canonici di sumoilazione, la cui sequenza è PKLE, e altri due siti potenzialmente sumoilabili GKVD e TKEE .

Sono stati creati costrutti mutanti in cui la lisina K) dei siti canonici era convertita in arginina R . La lipofezione dei costrutti singoli mutanti K→ R 148 e K→ R 1 1 mettere aa) e del doppio mutante K→ R 148 161) a livello di retina presuntiva ha portato come effetto una perdita della capacità di Xbh1 di indurre cellule gangliari; nel caso dei singoli mutanti questa riduzione non sembra significativa, mentre il doppio mutante perde completamente la capacità di indurre il destino gangliare nei progenitori retinici. Anche se la funzione biologica del doppio mutante era nulla, la presenza di altri due siti rende Xbh1 potenzialmente sumoilabile su altre posizioni non canoniche. In effetti solo nel quadruplo mutante di Xbh1, saggi di trasfezione in cellule HEK293 mostrano la totale o quasi totale assenza di sumoilazione della proteina Xbh1 Fig. 1 5 .

Per questi saggi, costrutti sono stati da me generati nel corso del tirocinio della laurea triennale e sono stati inviati presso il Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Chimica delle Macromolecole, Universita` degli Studi di Trieste dove il Dr Licio Collavin e i suoi collaboratori hanno effettuato saggi biochimici di sumoilazione. I costrutti con le sequenze di Xbh1 wt e mutanti sono stati trasfettati insieme a un costrutto GFP SUMO in cellule HEK 93 per poi fare un saggio di shift .

elettroforetico. Se avviene sumoilazione la proteina di fusione GFP SUMO viene coniugata alla proteina XBH HA, diminuendone la mobilità elettroforetica, come osservato, dopo SDS PAGE e western blot, rilevando la migrazione della proteina di fusione con un anticorpo anti HA ( Fig. 1 5)

Fig. 1 5: risultato di western blot La forma GFP Sumo DC , delta C, ha una delezione al C terminale che è l estremità che lega la lisina bersaglio per cui non può interagire con nessuna proteina, è un controllo. Nella prima linea si trova la frazione di proteina Xbh1, nelle varie forme, ritardata nella corsa su gel dal legame con GFP Sumo, con la mutazione di tutti e quattro i siti sumoilabili la proteina Xbh1 è quasi totalmente non sumoilata. Nella seconda la frazione di proteina Xbh1 che ha migrato alla sua altezza normale. Nella parte inferiore della figura c è una corsa di controllo in cui è stato usato l anticorpo anti GFP per far vedere che dove sumo non può legarsi ad alcun bersaglio cioè la forma con la delezione, migra in basso. Nel controllo anti GFP per il quadruplo mutante si ha lo stesso un andamento a ladder perché Sumo ha interagito con tutte le altre proteine sumoilabili presenti nelle cellule.