RETROVIRUS

GENERALITA'

Ribovirus provvisti di involucro pericapsidico, il cui genomaè formato da 2 molecole di RNA di polarità positiva che non vengono però tradotte direttamente e sono retro-trascritte ad opera di una DNA-polimerasi RNA-dipendente (trascrittasi inversa) presente nel virione, in altre molecole di DNA bicatenario (provirus) che si integrano nel genoma della cellula ospite, e poi vengono trascritte ad opera della RNA-polimerasi II della cellula.

Le 2 molecole di RNA, sono mantenute insieme, a livello delle estremità 5' mediante legami idrogeno tra sequenze complementari. La molecola di RNA genomico è appaiata con una piccola molecola di RNA di origine cellulare tRNA, la cui funzione è di innesco (primer) x la trascrittasi inversa.

Il genoma dei Retrovirus contiene almeno 3 geni, necessari e suffienti alla replicazione completa; questi si susseguono dall'estremità 5' nella sequenza :

gag → codifica proteine strutturali del core (capsidiche e nucleo-capsidiche)

pol → (da polimerasi) codifica le proteine enzimatiche (trascrittasi inversa, proteasi)

env codifica le proteine che una volta glicosilate formano le glicoproteine virus-specifiche dell'envelope (pericapside) virale.

Oltre ai 3 geni sono presenti alcuni geni che codificatori di proteine regolatrici ed accessorie.

La famiglia dei Retroviridae è divisa in III sottofamiglie:

I ) ONCOVIRINAE → gli Oncovirus comprendono i : Retrovirus dotati di potere oncogeno

suddivisi in : - Oncovirus esogeni, capaci di trasmissione orizzontale

tra i diversi individui della stessa specie ospite;

- Oncovirus endogeni, trasmissibili solo verticalmente,

come provirus integrati nelle cellule della linea

germinale.

I retrovirus patogeni x l'uomo appartenenti alla sottofamiglia degli oncovirus, rappresentati dai virus associati alla leucemia/linfoma a cellule T dell'adulto (HTLV-1 e HTLV-2).

II) LENTIVIRINAE → i Lentivirus comprendono retrovirus che provocano manifestazioni

patologiche dopo un lungo periodo di incubazione.

I retrovirus patogeni x l'uomo rappresentati da virus responsabili della Sindrome da Immunodeficienza acquisita AIDS, rappresentati da i virus denominati HIV, HIV-1(diffuso in tutto il mondo, è responsabile della > parte dei casi di AIDS) e HIV-2 (presente il Africa occidentale, nei Carabi, e nell'America meridionale, è meno virulento e provoca una malattia a decorso + attenuato)

III) SPUMAVIRINAE → nelle colture di cellule infette provocano una intensa formazione di

vacuoli di aspetto schiumoso.

VIRUS RESPONSABILI DELL'AIDS

Oltre ai geni gag, pol, env, il genoma HIV comprende altri 6 geni i cui prodotti hanno funzioni regolatorie/accessorie nel ciclo di replicazione virale.

I geni gag, pol, env sono tradotti in poliproteine che sono poi scisse nelle proteine funzionali definitive che si assemblano, insieme alle 2 molecole di RNA nel virione completo.

. I geni gag e pol -> sono cotradotti inizialmente in una poliproteina che viene scissa in:

proteina p55 -> che a sua volta viene scissa in :

- proteina p17 (che legandosi alla faccia interna

della zona di membrana cellulare, da cui deriverà il

peplos virale, rappresenta la matrice;

- proteina p24: che forma l'involucro del core ed uno

degli antigeni virali + rappresentati CA;

- proteina p9: che si lega alle molecole di RNA (proteina

nucleo capsidica (NC).

enzimi virus specifici: - proteasi (PR)

- trascrittasi inversa (RT)

- endonucleasi/integrasi (IN)

. Il gene env -> è tradotto inizialmente in una poliproteina (p88) che viene glicosilata e scissa

nelle 2 glicoproteine: - gp41 -> è inserita attraverso l'involucro lipidico

pericapsidico (proteina transmembranaria

TM);

- gp120 -> ancorata con la porzione COOH-

all'estremità NH₂ terminale di gp41, è

esposta alla superficie del virione.

Le proteine regolatrici ed accessorie

. proteina Tat -> è una proteina che una volta sintetizzata, rientra nel nucleo cellulare e funziona da transattivatore della trascrizione del genoma provirale. Tat si lega ad una specifica sequenza degli mRNA nascenti, è un elemento fondamentale del complesso trascrizionale del provirus di HIV. Tat è in grado di legare il complesso "ciclina T1" che fosforila diversi siti presenti nell'estremo C-terminale della RNA-polimerasi II, che risulta capace di portare a termine la completa trascrizione del provirus. Tat viene eliminato all'esterno della cellula produttrice e può interagire sia con la membrana della stessa cellula produttrice (loop autocrino) sia con quella di cellule vicine non infette (loop paracrino) provocando l'innesco di segnali in grado di indurre l'attivazione di diversi fattori trascrizionali.

. proteina Rev -> ha una funzione importante nel regolare la sequenza nella produzione di RNA virus-specifici. Una volta prodotta Rev rientra nel nucleo ed interagendo con specifiche sequenze presenti nella regione "env" degli mRNA li protegge dallo splicing ad opera degli appositi organuli nucleari consentendo l'esportazione dal nucleo degli mRNA .

. proteina Vpu -> funzione di facilitare il trasporto del prodotto del gene env verso la membrana cellulare;

. proteina Nef -> funzione molto simile a quella di Vpu ed agisce legandosi alle molecole di CD4 e HLA-I di cui facilita il trasposto, dalla superficie cellulare e dall'apparato del Golgi, verso i lisosomi, favorendo la degradazione.

. proteina Vif -> viene incorporata nel virione di cui favorisce l'infettività e sembra avere una funzione durante l'assemblaggio del core virale.

. proteina Vpr -> viene incorporata nel virione e sembra avere un ruolo importante nel favorire il trasporto intranucleare del complesso nucleoproteico (genoma provirale e proteine associate).

Il ciclo replicativo di HIV

Il principale recettore cellulare specifico x HIV è la molecola CD4 che è rappresentata alla superficie dei linfociti T-helper e che funziona da ligando specifico x le molecole di MHC di classe II, nei processi di interazione cellulare legate al riconoscimento dell'antigene. La molecola CD4 è presente anche alla superficie di una notevole percentuale di monociti, macrofagi tissutali, cellule dendritiche follicolari dei linfonodi. Linfociti TH-CD4(+) e altre cellule CD4(+) rappresentano le principali popolazioni cellulari sensibili all'infezione da HIV.

CD4 è il recettore fondamentale x il quale la glicoproteina gp120 presente nell'envelope virale (che rappresenta l'antirecettore) presenta un'elevatissima affinità.

Per consentire l'infezione da HIV è necessaria la presenza, insieme a CD4, di co-recettori:

. Alla superficie dei macrofagi è presente il co-recettore CCR5 e la sua presenza è

essenziale x l'infezione degli stipiti macrofagotropi.

. Gli stipiti di HIV-1 linfotropi, utilizzano come co-recettore la molecola di superficie

CXCR4 (che è il recettore x la chemochina SDF-1).

Tutti e 2 i principali corecettori sono espressi alla superficie dei linfo-monociti CD4(+) del sangue periferico, ciò spiega la loro sensibilità all'infezione, sia con stipiti linfotropi che con stipiti macrofagotropi.

La contemporanea interazione tra gp120 -> CD4 e di un corecettore dall'altra, provoca una serie di alterazioni conformazionali, che si traducono nella fusione dell'envelope virale con la membrana della cellula e la liberazione nel citoplasma cellulare del nucleo-capside. A questo punto si verifica la retrotrascrizione del genoma virale nel DNA provirale e l'integrazione del "provirus" nel genoma della cellula.

La variabilità genomica di HIV

Una delle + evidenti caratteristiche del genoma di HIV è rappresentato dal notevole grado di variabilità dimostrabile tra differenti stipiti virali isolati da diversi individui o addirittura tra gli stipiti virali isolati dallo stesso individuo in momenti diversi dell'infezione.

La variabilità genomica di HIV-1 è rilevante x diversi aspetti: la distribuzione delle sequenze variate tra i diversi stipiti non è ugualmente distribuita in tutto il genoma provirale, infatti le sequenze env e nef sono è soggette a variazioni mentre gag e pol sono + conservate.

Le glicoproteine di superficie contengono alcune regioni altamente conservate, tutti i residui di cisteina di gp120 e gp41 sono costanti nella quasi totalità dei virus, ciò è legato al fatto alla funzione della cisteina di mantenere un'adeguata configurazione tridimensionale delle proteine di superficie. Nella gp120 sono presenti 4 sequenze aminoacidiche relativamente costanti (C1-C4) intercalate con regioni ipervariabili (V1-V5),una delle quali corrisponde al principale epitopo in grado di evocare la produzione di anticorpi, ciò comporta che gli anticorpi sono poco efficaci nei confronti di altri anticorpi che si possono produrre nel corso di una infezione.

Rapporti filogenetici dei diversi sottotipi genomici/antigenici di HIV-1 e HIV-2

Si ritiene con molta probabilità che i retrovirus umani HIV-1 e HIV-2 abbiano avuto la loro origine in Africa nei primi decenni del secolo XX.

. Gli stipiti di HIV-1 circolanti nella specie umana, sono classificati in 3 distinti gruppi:

gruppo M (major) → comprende la grande maggioranza dei virus responsabili della pandemia, è ulteriormente divisibile in una serie di almeno 11 sottotipi (da A a K). I Paesi europei e gli USA sono interessati dal sottotipo B. Sembrano il risultato di un unico evento originario di trasmissione scimpanzé-uomo.

gruppo O (outlier) → stipiti diversi e poco numerosi. Il virus O e quello N sembrano il risultato di ulteriori, indipendenti eventi di trasmissione scimpanzé-uomo.

Gruppo N (non M) → è un virus assolutamente peculiare in varie seq nucleotidiche.

. Gli stipiti di HIV-2 sono divisibili in almeno 6 (A a F) sottotipi e rappresentano il risultato di altrettanti eventi indipendenti di trasmissione dell'infezione dalle scimmie cercopitecidi all'uomo. Il > numero di infezioni ha HIV-2 è causato dal sottotipo A , seguito dal sottotipo B.

PATOGENESI DELL'AIDS

L'infezione da HIV rappresenta la tappa iniziale di un processo che oltre il 90% dei casi si traduce, in un periodi di tempo variabile (da 7 a 10 anni) in un drammatico quadro patologico, che si conclude con la morte del paziente.

L'infezione è sempre la conseguenza dalla trasmissione di tracce anche inavvertite di sangue, o altri liquidi biologici da un soggetto infetto ad un soggetto san, attraverso rapporti sessuali, l'uso promiscuo di siringhe tra i tossicodipendenti, ma anche attraverso trasmissione iatrogena (donazione di sangue, organi, tessuti, o attraverso la somministrazione di emoderivati infetti). L'infezione si trasmette anche dalla madre infetta al feto, x via trasnplacentare o durante il parto e il successivo allattamento.

L'infezione primaria è asintomatica, dopo un periodo di incubazione di3-6 settimane si traduce in una malattia acuta, febbrile, senza una sintomatologia patognomica (che simulano una mononucleosi infettiva) che si esaurisce spontaneamente nel giro di alcuni giorni ed è difficilmente diagnosticabile, senza un preciso sospetto epidemiologico. L'infezione primaria si accompagna ad un elevato titolo di virus nel sangue periferico (viremia) e nel giro di 1 settimana si produce un'intensa risposta immunitaria che provoca la scomparsa della viremia.

Fase di latenza clinica, il virus viene sequestrato negli organi linofoidi (linfonodi) soprattutto all'interno delle cellule dendritiche follicolari, e c'è assenza di manifestazioni morbose evidenti che può durare x diversi anni. Anche se il provirus è integrato nel genoma delle cellule infette e si trova allo stato latente in molte di esse, in un certo numero di cell si osserva una continua replicazione virale che si accompagna alla liberazione di virus e di prodotti (proteine) virus-specifici (solubili che innescano i circuiti patogenetici).

I soggetti affetti da HIV presentano un progressivo calo nel numero di linfociti CD4+ circolanti (1000/ mm³ nel soggetto normale) che non si traduce in una manifestazione morbosa drammatica fintanto che i linfociti T4 superano i 5-600/mm³.

Sintomatologia iniziale: linfoadenopatia persistente (LAS). Quando la proliferazione virale raggiunge valori critici, cominciano ad essere presenti anche i primi sintomi morbosi.

Stadio ARC: che inizia subito dopo, caratterizzato da calo ponderale, febbre, diarrea ed astenia che si accompagna ad una ulteriore netta diminuzione dei linfociti T-helper circolanti con variabili segni di anemia, ed altre emocitopenie periferiche, ipergammaglobulinemia. In molti soggetti infetti la comparsa di una patologia conclamata si associa alla prevalenza di una popolazione virale CXCR4 linfotropica e con la riduzione di virioni CCR5 (macrofago-tropici) che invece prevalgono nelle fasi iniziali dell'infezione.

Fase di AIDS conclamata: diminuzione dei linfociti T-helper al di sotto dei 3-400/mm³. I linfonodi presentano gravi lesioni involutive, è presente nel sangue una intensa viremia; la sitomatologia si complica con l'insorgenza di infezioni da microrganismi opportunisti che evolvono con inusuale gravità. In molti casi si associa la comparsa di affezioni neoplastiche (sarcoma di Kaposi). In un numero variabile di pazienti sono anche presenti lesioni degenerative del SNC. Nei neonati infetti l'infezione è molto + rapida e si conclude con la morte nel giro di 5-6 anni.

I 2 fondamentali parametri diagnostici e prognostici dell'HIV:

1°) numero dei linfociti T-helper circolanti nel sangue periferico;

2°) livello di virus svelabile (viremia).

Caratteristiche fondamentali della patologia conclamata:

a)     grave ed irreversibile compromissione della capacità di risposta immune, che si traduce in una serie di infezioni da virus e microrganismi (batteri, protozoi, miceti) opportunisti.

b)     Comparsa di manifestazioni neoplastiche (linfomi, sarcoma di Kaposi)

c)     Alterazioni ematologiche periferiche (trombocitopenia, anemia, granulocitopenia) con gravi compromissioni del sistema ematopoietico

d)     Lesioni degenerative del SNC che si accompagnano ad atrofia della massa encefalica (demenza associata all'AIDS).

♦ L'immunodeficienza è l'aspetto patogenetico + rilevante della sindrome con la notevole riduzione del numero dei linfociti T-helper (linfociti T-CD4+ o linfociti T4). Cmq il numero di T4 infetti da virus non supera mai il 20-30% della popolazione, la loro totale distruzione dei linfociti T4 non-infetti è dovuta all'induzione della morte programmata (apoptosi) attraverso l'innesco di segnali cellulari conseguenti all'interazione fra la glicoproteina gp120, liberata in gran quantità dalle cellule infette da HIV-1. Oltre alla gp-120, anche la proteina trasnattivante Tat viene liberata nell'ambiente dalle cellule infette da HIV-1 e può funzionare da amplificatore del danno cellulare.

Gli stessi meccanismi sembrano responsabili della compromissione della vitalità e della capacità di differenziamento delle cellule ematopoietiche progenitrici presenti nel sangue circolante e nel midollo osseo.

Anche le lesioni del SNC sono conseguenza di meccanismi analoghi; infatti i neuroni non sono infetti da HIV-1 che invece si replica nelle cellule accessorie, liberando gp120 che ha un'azione tossica x i neuroni innescandone la morte x apoptosi.

DIAGNOSI DI LABORATORIO

L'infezione da HIV è seguita dalla costante e progressiva replicazione del virus in una serie di organi bersaglio ed è destinata a sfociare nella definitiva compromissione del sistema immunitario.

L'infezione da HIV una volta verificatasi si mantiene costantemente attiva, la sieropositività, cioè la rivelazione della presenza di anticorpi specifici x HIV nel siero di un individuo, consente di porre inequivocabilmente la diagnosi di infezione in atto (anche se clinicamente silente).

v    Ricerca di anticorpi: si esegue mediante reazioni immunoenzimatiche nei confronti di antigeni "ricombinanti" e/o di peptidi sintetici che riproducono gli epitopi antigenici + significativi delle principali proteine strutturali del virus HIV-1 e HIV-2. I limiti di utilizzo:

nella fase iniziale (3-4 settimane) nella quale la quantità di anticorpi circolanti non è

ancora sufficiente ad essere evidenziata dalle tecniche di rivelazione;

nei neonati da madri infette da HIV, i quali possiedono anticorpi sierici anti-HIV di origine materna;

nei soggetti infetti in cui i risultati delle indagini sierologiche possono dare risultati di dubbia positività (borderline).

v    Ricerca di HIV : può essere condotta mediante isolamento del virus in coltura allestendo co-colture di cellule mononucleate del sangue periferico del soggetto in esame con cellule mononucleate del sangue periferico di donatori normali, si monitora la comparsa di antigeni virus-specifici nel sovranatante delle cellule. La ricerca della presenza di virus (nel sangue periferico) viene eseguita mediante la rivelazione della presenza di antigeni specifici (ricerca di proteina p24 del core) e/o la ricerca di specifiche sequenze nucleotidiche (DNA provirale, RNA virionico) con idonee metodiche di amplificazione (P.C.R.)

v    Nel follow-up del paziente: x monitorare l'efficacia della terapia antivirale è essenziale stabilire la quantità di virus ("carico virale") presente in circolo. I parametri utili sono:

determinazione quantitativa del DNA provirale mediante P.C.R., che misura la quantità di virus latente "provirus", che rappresenta un'indicazione dell'ampiezza del reservoir di virus presenti nell'organismo.

determinazione della quantità di virus infettante presente nel sangue periferico misurata in colture di cellule in vitro

determinazione dei livelli plasmatici della proteina capsidica p24

determinazione quantitativa di HIV-1 RNA nel plasma.

TERAPIA E CONTROLLO DELL'AIDS

La terapia : con una serie di farmaci antivirali specifici, costituiti da:

inibitori nucleosidici e non nucleosidici della trascrittasi inversa;

farmaci inibitori specifici della proteasi virale

farmaco che agisce inibendo la fusione del peplos del virione con la membrana delle cellule sensibili.

Questi farmaci xò presentano una serie di effetti collaterali (tossicità secondaria degli inibitori della proteasi con scarsa compliace dei pazienti, emergenza di stipiti farmaco-resistenti) non consentono di attuare un trattamento prolungato.

Il controllo : dell'infezione è affidato a misure preventive generali come lo screening dei donatori (di sangue, di organi o tessuti) il controllo del sangue e degli emoderivati, l'educazione sessuale.

RETROVIRUS ASSOCIATO ALLA HTLV

(leucemia umana a cellule T dell'adulto)

Il retrovirus denominato HTLV ha i caratteri generali dei retrovirus, se ne conoscono 2 tipi sierologici ( HTLV-I e HTLV-II). Il genoma di HTLV-1 oltre ai 3 geni:

- gag, pol, env che codificano x 3 poliproteine che subiscono una scissione proteolitica da cui prendono origine: le proteine e le nucleoproteine del core virale, le proteine enzimatiche (proteasi, trascrittasi inversa) e le glicoproteine dell'envelople;

- sequeze con i caratteri di ORF (open reading frame), e di cui la sequenza + lunga è denominata sequenza pX. La regione pX contiene almeno 4 distinti ORF di cui le 2 maggiori, ciascuna formata da 2 esoni distinti: Tax e Rex con funzioni analoghe alle proteine Tat e Rev di HIV.

▪ HTLV-1 sembra in grado di interagire, tramite le glicoproteine dell'envelope con numerosi tipi di cellule ma solo x i linfociti T-CD4+ i virus hanno uno spiccato tropismo.

▪ I virioni liberi sono scarsamente infettanti e l'infezione si trasmette efficacemente solo attraverso un cotatto diretto tra cellule infette e cellule contigue, mediante un complesso processo di adesione cellulare.

EZIOLOGIA

▪ HTLV-1 è associato a una rara forma di leucemia/linfoma dell'adulto a cellule T (ALT). È una rara e aggressiva forma di leucemia umana individuata all'inizio degli anni 70'. Presenta :

a)     insorgenza in età adulta;

b)     derivazione delle cellule leucemiche da linfociti T-helper maturi

c)     frequente coinvolgimento della cute (linfoma cutaneo), linfoadenopatie ed epatosplenomegalia

d)     elevato numero di leucociti circolanti senza anemia e scarso coinvolgimento del midollo osseo

e)     ipercalcemia

Il periodo di sopravvivenza dall'inizio dei sintomi acuti, varia da 2 settimane a + di 1 anno e la morte è provocata da: complicazioni infettive polmonari.

MECCANISMO D'AZIONE PATOGENA

L'infezione si trasmette x via ematogena ed anche attraverso l'allattamento. Il provirus è integrato nel genoma cellulare.

Il meccanismo d'azione oncogena è associato all'azione transattivante di Tax che oltre a transattivare la trascrizione del genoma provirale è in grado di transattivare numerosi geni cellulari, tra i quali il gene che codifica la IL-2 (specifico fattore di crescita x le cellule T) e il gene che codifica lo specifico recettore (IL-2R). Si crea così una sorta di perverso circuito autocrino in grado di stimolare la replicazione policlonale delle cellule infette.

Le cellule proliferanti offrono un'aumentata probabilità all'insorgenza di un "secondo evento " in grado di trasformare la cellula in una cellula indefinitamente e patologicamente proliferante con la comparsa della leucemia acuta, clinicamente manifesta.

Altre patologie associate ad HTLV-1

Esiste una associazione tra l'infezione da HTLV-1 e una rara patologia neurologica rappresentata da una sindrome demielinizzante progressiva: paraparesi tropicale spastica.

EPIDEMIOLOGIA DELL'INFEZIONE

In Europal'infezione da HTLV-I e II è particolarmente diffusa in particolari gruppi a rischio sono rappresentati da tossicodipendenti assuefatti dall'assunzione di droghe x via endovenosa (ed è spesso associata all'infezione da HIV).

DIAGNOSI DI LABORATORIO

La diagnosi di laboratorio si basa sulla ricerca di anticorpi mediante reazioni immunoenzimatiche e/o immunoblotting, nei confronti di antigeni virali e sulla ricerca di specifiche sequenze del DNA provirale nelle cellule mononucleate del sangue periferico mediante P.C.R.