COLTIVAZIONE E TITOLAZIONE DEI VIRUS

Dato che i virus sono parassiti obbligati intracellulari, x poter ottenere la moltiplicazione in laboratorio è necessario disporre di cellule viventi (animali da laboratorio, embrioni di pollo e colture di cellule) sensibili e permissive da utilizzare come supporto della moltiplicazione virale.

COLTURE DI CELLULE

Il tipo di colture cellulari + usato in virologia è ottenuto mediante la coltivazione di singole cellule ricavate mediante la dissociazione dei tessuto di origine attraverso il trattamento con enzimi proteolitici.

Le cellule vengono coltivate in contenitori di vetro o plastica dove crescono aderendo alla parete che costituisce il fondo del recipiente e sulla quale si moltiplicano fino a coprirla completamente con un monostrato cellulare.

I terreni di coltura sono molto diversi nei singoli componenti a seconda dei tipi di cellule che si desidera coltivare, cmq tutti sono costituiti da:

              .  soluzione isotonica pH 7,4

              .  glucosio, aminoacidi, vitamine e coezimi

              .  siero animale (siero fetale di vitello 10%)

- "Colture primarie" -> colture cellulari preparate a partire da un organo animale. Sono formate da diversi tipi di cellule con le stesse caratteristiche di quelle presenti nell'organismo originale e sono in grado di consentire la moltiplicazione di numerosi virus. Le sorgenti + comuni di colture primarie: rene di scimmia (corticale), vari organi (polmone, reni) di feti umani e cellule amniotiche umane.

- " Stipiti cellulari" ->  Le cellule di tipo fibroblastico presenti in colture primarie, possono essere mantenute in vitro, mediante passaggi seriali,  x lunghi periodi e sono un ottimo substrato x lo studio di numerosi virus animali. Queste colture possiedo una vita finita, la loro capacità moltiplicativa si arresta dopo alcune decine di generazioni. Congelando le cellule (in presenza di glicerolo) a temperature molto basse (-80°C) è possibile superare l'ostacolo della vita finita.

- "Linea cellulare" ->  Alcune cellule di origine tumorale divengono capaci di riprodursi illimitatamente in vitro Le cellule sono altamente indifferenziate, poliploidi e aneuploidi. Le linee cellulari sono la sorgente di cellule + comoda, poiché esse possono essere mantenute in laboratorio, in coltura o congelate senza limiti di tempo.  Alcune linee cellulari usate nello studio dei virus umani sono denominate con le sigle: HeLa, KB, Hep2 (colture allestite inizialmente da carcinomi umani).

RICONOSCIMENTO DELLA MOLTIPLICAZIONE VIRALE NELLE COLTURE:

- Comparsa di alterazioni cellulari (effetto citopatico o ECP) che si esprimono in fenomeni di necrosi, citofagia, di agglutinazione cellulare, formazione di sincizi e sono apprezzabili all'osservazione MO.

- Altre volte xò la moltiplicazione di virus nn si accompagna a lesioni cellulari morfologicamente apprezzabili,  e la presenza del virus è messa in evidenza indirettamente mediante:

a)     la presenza di potere emoagglutinante  nel liquido della coltura (x i virus ke possiedono questa capacità);

b)      mediante la ricerca di inclusioni

c)     dimostrando la presenza di antigeni virali nelle cell x mezzo di anticorpi marcati con sostanze fluorescenti

- Impiego di animali da esperimento:

a)     nell'embrione di pollo i virus vengono inoculati attraverso appositi fori praticati nel

                 guscio, nei liquidi delle cavità allantoidea, cavità amniotica. La moltiplicazione dei virus

                 si apprezza in seguito alla morte dell'embrione, alla comparsa di potere amoagglutinante

                 nei liquidi embrionali;

b)     l'unico animale da laboratorio che oggi si impiega x l'isolamento di virus è costituito 

              dal topino neonato (coxsackievirus , tagavirus). Esso viene inoculato x via intracerebrale,

              intraperitoneale e la moltiplicazione virale si appalesa con la comparsa di segni morbosi

              (paralisi, rigidità, tremore) o con la morte dell'animale.

TITOLAZIONE DEI VIRUS

Per stabilite la concentrazione o titolo virale (cioè la quantità di virus in un dato materiale), il metodo + usato consiste nella determinazione del titolo infettante del materiale in esame, il quale è direttamente proporzionale al numero di virioni completi in esso presenti.

La titolazione dell'infettività può essere eseguita con :

metodo diretto -> consiste nella numerazione delle placche di citolisi prodotte da una sospensione virale diluita in un monostrato di cellule e può essere paragonata alla conta dei batteri presenti in un materiale, in base al numero di colonie prodotte in piastre di agar-germi. Procedimento: il materiale in esame viene diluito (in serie logaritmica) e le varie diluizioni sono inoculate in piastre contenenti un monostrato di cell. Dopo un tempo sufficiente a consentire la penetrazione del virus nelle cellule (1h a 36°C) il monostrato viene ricoperto con terreno di coltura solidificato con agar. Accadrà che in alcune piastre inoculate con il materiale sufficientemente diluito, saranno presenti inizialmente poche particelle virali iniziali. Ognuno dei virioni presenti nell'inoculum iniziale, infetterà cellule molto distanti fra loro e la progenie virale che si produrrà dalle singole cellule inizialmente infette, nn potendo diffondere inizialmente liberamente nel terreno a causa della viscosità si trasmetterà solo alle cellule contigue, dando luogo a un focolaio localizzato di distruzione (caso virus citolitici) o alla formazione di foci delle cell alterate. Poiché in queste condizioni ogni virione infettante presente nell'inoculo iniziale dà luogo ad un focolaio o ad una placca di citolisi è facile risalire al titolo infettante del materiale di partenza.

Un altro metodi di titolazione diretta: inoculazione sulla superficie esterna della membrana corion-allantoidea dell'embrione di pollo: la quale nn essendo bagnata da alcun liquido embrionale consente la diffusione dell'infezione a partire dalle cellule primitivamente infette, solo x continuità. Ciò è possibile solo x i virus che producono lesioni evidenti sulla membrana (poxvirus, herpesvirus)

metodo indiretto: si inoculano diluizioni progressive del materiale in esame in serie di 4 o 5 colture cellulari, uova embrionali o animali da laboratorio; si aspetta il tempo necessario xchè anche una singola particella virale possa provocare la distruzione della coltura cellulare, la morte o la comparsa di lesioni nell'animale e si stabilisce la diluizione massima del materiale capace di provocare un effetto virus-specifico in almeno 1 degli stipiti impiegati.

EMOAGGLUTINAZIONE

Molti virus sono provvisti di proteine superficiali in grado di legarsi alla membrana di eritrociti di diverse specie animali, formando dei ponti fra i diversi eritrociti e provocandone la agglutinazione. Gli eritrociti agglutinati sedimentano al fondo delle provette in modo irregolare ricoprendo tutta la calotta emisferica del fondo, mentre gli eritrociti nn agglutinati sedimentano regolarmente in un disco compatto al centro del fondo della provetta.

CONTA DEI VIRIONI AL MICROSCOPIO ELETTRONICO

Per scopi particolari può essere utile procedere ad un conteggio diretto di virioni in preparati colorati negativamente e osservati al ME. La sospensione virale viene mescolata con una sospensione a concentrazione nota di particelle submicroscopiche di latex. Con questo metodo, poiché si evidenziano anche i virioni inattivati il titolo virale che si ottiene è + elevato di quello derivabile dai metodi di titolazione sulla base della inattività.

ALTRI METODI -> x la determinazione della quantità di un virus presente in diversi materiali, sia in vivo che in vitro: dosaggio di anticorpi virus-specifici ( reazioni immunoenzimatiche); dosaggio degli acidi nucleici virali (mediante reazione polimerasica a catena P.C.R.).