Separazione dei frammenti in gel di poliacrilammide e colorazione: metodo Silver staining

Separazione dei frammenti in gel di poliacrilammide e colorazione: metodo Silver staining

Il metodo Silver staining è un'alternativa non radioattiva per l'analisi di sequenze [1], basata su una rilevazione fotochimica di macchie d'argento originariamente disegnata per la rilevazione di proteine. I parametri fondamentali per una buona riuscita dello sviluppo del gel sono: la purezza dell'acqua e la freschezza dei reagenti utilizzati. Il gel, una volta terminata la corsa elettroforetica, viene fissato in acido acetico per rimuovere il tampone dell'elettroforesi e l'urea presente nel gel. Il fissaggio è molto importante per la sensibilità del metodo, un fissaggio troppo breve o troppo lungo comporterebbe un inefficiente sviluppo del gel Un tempo minimo di 5 minuti in immersione in acido acetico è in grado di mantenere nei limiti la rilevazione dei vari frammenti di DNA. Questo passaggio permette di rimuovere sia l'acido acetico che i componenti solubili del gel che interferirebbero con la colorazione. E' opportuno effettuare un minimo di risciacquo in acqua de-ionizzata, tenendo conto che se passa troppo tempo lo sviluppo può diventare troppo sbiadito.

Dopo il fissaggio, il gel viene posto in una soluzione di colorazione, contenente nitrato d'argento e formaldeide, la cui presenza impartisce sensibilità e contrasto provocando la riduzione l'argento presente anche in minime quantità. La realizzazione ottimale della colorazione è effettuata in 30 minuti, un periodo più lungo di 90 minuti causerebbe la perdita dell'immagine.

Successivamente alla reazione di colorazione il gel viene risciacquato velocemente con acqua ultrapura per rimuovere l'eccesso d'argento. Questo passaggio permette di rimuove sia l'acido acetico sia i componenti solubili del gel che interferirebbero con la colorazione. E' opportuno eseguire un minimo di risciacquo di 3 minuti in acqua de-ionizzata, tenendo conto che, se passa troppo tempo, lo sviluppo può risultare sbiadito.

Dopo il risciacquo il gel deve essere immediatamente sviluppato in una soluzione alcalina di carbonato di sodio, formaldeide e tiosolfato di sodio a basse temperature (8-12°C). In queste condizioni, la presenza di tiosolfato altera la cinetica della riduzione dell'argento: complessandosi con gli ioni argento il tiosolfato crea i sali d'argento aiutando a minimizzare il background. La velocità della reazione è temperatura-dipendente ed è fermata da un'ulteriore aggiunta di acido acetico.

Lo sviluppo dell'immagine richiede un cambiamento brusco del pH con l'inevitabile formazione dei sali d'argento, questi precipitando attaccano la superficie del gel e degradano il contrasto d'immagine incrementando il background di colorazione. Per evitare la formazione dei sali d'argento e per rimuovere l'eccesso dei reagenti il gel è allora risciacquato in acqua. Il decrescere della concentrazione dell'argento sulla superficie del gel, precedentemente risciacquato, elimina la precipitazione dell'argento ma aumenta la sensibilità. In ogni caso gli ioni d'argento complessati, fanno decrescere la concentrazione di ioni liberi d'argento riducendo la cinetica di riduzione, e accrescendo il potenziale redox che circonda la matrice del gel, minimizzando il background di colorazione. Il tempo necessario allo sviluppo può variare da alcuni secondi a minuti ed è possibile recuperare l'argento utilizzato precipitandolo con cloruro di sodio.

Sono disponibili diversi kit in commercio, nel nostro caso è stato usato "SILVER SEQUENCE^TM DNA Stainig Reagents" della ditta Promega.

1 Trattamento dei vetri

I vetri usati per formare il gel devono essere accuratamente lavati con acqua de-ionizzata e con etanolo al 70% poiché residui e impurità provocherebbero un elevato background.

Il vetro più piccolo, quello deputato all'attacco del gel sulla sua superficie, deve essere trattato con una soluzione di 1,5 ml di Etanolo 95% e acido acetico 0,5% alla quale viene aggiunta 4,5 µl di Bind Silane (Sigma), un composto che consente l'adesione del gel al vetro.

Si cosparge il vetro con 750 ml di soluzione e si distribuisce uniformemente con della carta lasciando asciugare, dopo 5 minuti si aggiungono i 750 ml di soluzione rimanenti e si lascia asciugare per altri 5 minuti, Al termine si rimuove l'eccesso con un fazzoletto imbevuto di etanolo al 70% facendo una leggera pressione.

Il vetro più grande non deve mai venire a contatto con le soluzioni di trattamento del vetro piccolo, a questo proposito è opportuno cambiare i guanti prima di cominciare il trattamento.

Il vetro accuratamente sciacquato con acqua ultra pura ed etanolo al 70% viene cosparso con 750 ml di soluzione Repeal (Fukla) dopo 5 minuti si ripete l'operazione con altri 750 ml di soluzione Repeal e dopo ancora 5 minuti si rimuove l'eccesso con un fazzoletto.

Se i vetri vengono contaminati devono essere immersi in NaOH al 10% per 30-60 minuti.

Preparazione Gel in Poliacrilammide

Viene preparata una soluzione stock sciogliendo in acqua 286g di urea e 68 ml di TBE (Tris borato EDTA) 10X in un volume finale di 600 ml. Da questa vengono prelevati 60 ml a cui vengono aggiunti 8 ml di poliacrilammide 40 % (formato da 19: acrilammide, 1: bisacrilammide), 34 µl di TEMED e 283 µl di ammonio persolfato (APS) al 10%. Le concentrazioni finali dei reagenti impiegati per ottenere tale gel risultano le seguenti: urea 7M, TBE 1X e acrilammide 5%.

3 Preparazione delle soluzioni per il fissaggio e lo sviluppo

Dopo la corsa elettroforetica si devono separare i due vetri, il gel dovrebbe essere saldamente attaccato al vetro piccolo. Si pone il vetro piccolo con il gel in una vasca di plastica contenente 2 L  di soluzione di fissaggio (1.8 l di acqua ultrapura e 200 ml di acido acetico glaciale assoluto). La vasca viene posta su un agitatore per 20 minuti fino a quando non sarà più visibile il colorante della corsa. Al termine della reazione di fissaggio si recupera circa un litro della soluzione. Il gel viene risciacquato con acqua ultra pura per tre volte per tre minuti ciascuna su un agitatore. Al termine del risciacquo il gel viene trasferito nella soluzione di colorazione (staining) contenente 2 l di acqua de-ionizzata, 2 g di nitrato d'argento e 3 ml di formaldeide al 37% e posto in agitazione per 30 minuti. Dopo questo passaggio viene immerso in acqua ultra pura per non più di 5 secondi e posto in metà della soluzione di sviluppo ( 2 litri di acqua ultrapura, 60 g di Na₂CO_3, 3 ml di formaldeide 37% e 400 μl di sodio tiosolfato). In questa soluzione viene agitato manualmente fino alla comparsa della prima banda visibile, e quindi passato nella rimanente metà soluzione di sviluppo fino a quando non si raggiunge la colorazione desiderata.

Per ultimo si aggiunge la soluzione stop, recuperata inizialmente, direttamente sul gel ed infine si trasferisce in una vasca di acqua ultrapura. (Tab.9)

Tab.9: Reagenti utilizzati per la reazione di silver staining.