Riconoscimento dell'antigene

RICONOSCIMENTO DELL'ANTIGENE

RECETTORI PER L'ANTIGENE DEI LINFOCITI

Sono clonalmente distribuiti per cui un clone di linfociti(progenie di una singola cellula) è provvisto di un recettore del tutto unico,diverso da quelli espressi da tutti gli altri cloni.

Sebbene ogni clone di B e T riconosca un antigene diverso,tutti i linf B e T rispondono in maniera sostanzialmente uguale al  riconoscimento dell'antigene.

Regioni costanti ( C): porzioni necessarie per l'integrità strutturale e le funzioni effettrici del recettore(conservate tra tutti i cloni di linfociti)

Regioni variabili (V):porzioni dei recettori deputate al riconoscimento dell'antigene(diverse mei differenti cloni di linfociti)contengono:

• Regioni ipervariabili o regioni che determinano la complementarietà (CDR) che formano la porzione del recettore che lega fisicamente l'antigene.

I recettori per l'antigene sono legati non covalentemente a molecole non polimorfe che svolgono la funzione di trasdurre il segnale all'interno della cellula.

Complesso recettoriale dei linf B (BCR) e T (TCR):costituiti da complesso di molecole che fungono da recettore antigenico e da trasduttrici del segnale.

ANTICORPI(recettori dei linfociti B)

Costituiti da:

• 2 catene pesanti identiche tra loro (catene Heavy H)
• 2 catene leggere identiche tra loro (catene Light L)

assemblate tra loro a costituire una forma di Y:ogni catena L è legata covalentemente ad una catena H e le due catene H sono legate covalentemente tra loro da ponti disolfuro.

CATENA L

1 dominio V_L contenente 3 regioni ipervariabili (CDR)

1 dominio C

CATENA H

• 1 dominio V_H contenente 3 regioni ipervariabili (CDR)
• 3-4 domini C

La variabilità maggiore è concentrata nella regione CDR3 in corrispondenza della giunzione delle regioni V e C

In seguito a proteolisi si ottengono:

• 2 Fab(fragment antigen binding)porzione dell'Ig necessaria per il riconoscimento antigenico e con capacità di bloccare l'infettività di microbi e tossine legati.

Costituita da: 1 catena L intera legata con S-S al frammento di catena H con V_H e C_H1

• 1 Fc(frammento cristallizzabile)porzione dell'Ig responsabile delle attività biologiche e delle funzioni effettrici degli anticorpi,e del legame con i fagociti e il complemento.

Costituita da: 2 porzioni di catena H con C_H2 e C_H3

Tra Fab e Fc è interposta una regione cerniera flessibile che conferisce una certa mobilità alle due regioni Fab permettendo il legame simultaneo a due epitopi antigenici separati tra loro da una certa distanza.

L'estremità C-terminale della catena pesante può essere ancorata alla membrana plasmatica(come nel BCR) o terminare con una sequenza di coda(Ig circolante)

TIPI DI CATENE

• 2 tipi di catena L (k e l)diversi per la regione C ma con funzione identica
• 5 tipi di catene pesanti (m,d,g,e,a)diversi per la regione C

ognuno dei due tipi di catena L può assemblarsi con uno qualsiasi dei 5 tipi di catena H.

isotipo o classe:esistono cinque isotipi in base alla catena H (IgM,IgD,IgG,IgE,IgA) indipendentemente dal tipo di catena leggera.I vari isotipi si differenziano per le caratteristiche chimico-fisiche,biologiche e per le funzioni effettrici.

IgG,IgD e IgE due siti di legame per l'antigene

IgA secrete come dimeri 4 siti di legame per l'antigene

IgM secrete come pentameri 10 siti di legame per l'antigene

SCAMBIO DI CLASSE/O ISOTIPICO) DELLA CATENA PESANTE

Il recettore per l'antigene dei linf B vergini è rappresentato da IgM e IgD di membrana.

A seguito di stimolazione da parte dell'antigene e dei linf T helper il clone di linf B antigene-specifici può espandersi e differenziarsi in una progenie di cellule secernente anticorpi di una qualsiasi delle 5 classi o isotipi.

Sebbene possa verificarsi uno scambio di classe,ogni clone di linf B mantiene sempre la stessa specificità originaria(poiché le regioni V non vengono modificate).Anche l'isotipo della catena L (ossia k o l) rimane fisso per tutta la vita di un linf B.

Gli anticorpi legano mediante interazioni reversibili e non covalenti(ponti idrogeno e interazioni elettrostatiche)un'ampia gamma di antigeni che và dalle macromolecole a composti chimici di piccole dimensioni.

Epitopi o determinanti:sono le porzioni dell'antigene riconosciute dagli anticorpi.

• Epitopi lineari:riconosciuti in base a sequenza
• Epitopi conformazionali:riconosciuti in base alla loro conformazione

Affinità: forza con cui il sito di legame dell'Ig interagisce con un epitopo antigenico.E' una vaiabile espressa come "forza di dissociazione" (K_d) che corrisponde alla concentrazione molare di un antigene necessaria per occupare in soluzione il 50% delle molecole di anticorpo disponibili.

Più bassa è la K_d maggiore sarà l'affinità

MATURAZIONE DELL'AFFINITA'

K_d in risposta primaria = 10^-6 - 10^-9 M

K_d in risposte secondarie = 10^-8 - 10^-11 M

Avidità:forza complessiva dell'interazione antigene-anticorpo(dal momento che ogni molecola di anticorpo può legare 2(IgD,IgG,IgE), 4 (IgA) o 10(IgM) epitopi di un antigene.)(quindi avidità > affinità)

Cross-reattività:anticorpi prodotti contro un certo antigene possono legarsi anche ad antigeni strutturalmente simili.

Nel BCR le Ig di membrana sono associate non covalentemente a due proteine accessorie dette Iga e Igb che fungono da trasduttori del segnale.

RECETTORE DEI LINFOCITI T(TCR)

Costituito da:

• catena a
• catena b

ciascuna catena è dotata di una regione variabile V e una regione costante C

Nella regione V di ciascuna catena del TCR esistono 3 regioni ipervariabili(CDR) di cui la CDR3 è quella dotata di maggiore variabilità.

Entrambe le catene del TCR sono ancorate alla membrana plasmatica ed entrambe partecipano al riconoscimento del complesso MHC-antigene

Il TCR non viene prodotto in forma solubile,non va incontro a scambio di classe o maturazione dell'affinità.

Epitopi immunodominanti:il TCR riconosce solo 1-3 residui aminoacidici di un peptide(alta discriminazione)

Nel TCR le catene a e b sono associate non covalentemente a 2 proteine accessorie dette  CD3 e catena x che fungono da trasduttori del segnale.

Inoltre l'attivazione T richiede l'impiego dei corecettori CD4 o CD8 che riconoscono regioni non polimorfe del MHC.

L'affinità del TCR è bassa (K_d 10^-5 - 10^-7) per cui il legame tra linf T e APC deve essere integrato da molecole accessorie.

MATURAZIONE LINFOCITARIA

Eventi comuni a linf T e B

I linf B maturano nel midollo osseo

I linf T maturano nel timo

3 tappe:

1. Proliferazione delle cellule immature

Stimolata da IL-7,un fattore di crescita di crescita prodotto dalle cell.stromali del midollo osseo e del timo.

2. Espressione dei geni  del recettore per l'antigene

I recettori per l'antigene sono prodotti da segmenti genici separati nella linea germinativa che si ricombinano tra loro nel corso della  maturazione linfocitaria.

3. Selezione dei linfociti che esprimono un recettore antigenico utile

Selezione positiva:sopravvivono solo i linf T immaturi che esprimono un recettore capace di riconoscere molecole MHC a livello timico e che ricevono dalle MHC timiche un segnale per la sopravvivenza e proliferazione.

Selezione negativa:elimina i linfociti che riconoscono ad alta avidità antigeni autologhi in quanto capaci di reagire contro antigeni self.

GENERAZIONE DELLA DIVERSIFICAZIONE RECETTORIALE

Le cellule emopoietiche del midollo osseo e i progenitori linfoidi più immaturi presentano i geni Ig e TCR nella configurazione germinativa ereditata.I loci delle catene pesanti e leggere delle Ig e quelli delle catene a e b del TCR contengono circa:

Un centinaio di segmenti genici V

Sequenze D (n>20) presenti solo nel locus della catena pesante delle Ig e il locus della catena b del TCR

Numerose brevi sequenze nucleotidiche dette segmenti genici J interposte tra i geni V e C.

Uno o pochi geni C

I segmenti che entrano nel processo di riarrangiamento vengono scelti del tutto casualmente.

ESPRESSIONE DEI GENI Ig

L'espressione di una catena pesante(H) Ig richiede 2 eventi di ricombinazione

• Giunzione D-J
• Congiungimento di un segmento V al complesso D-J

La ricombinazione somatica dei segmenti genici V(D)J è mediata dall'enzima ricombinasi V(D)J  che riconosce sequenze di DNA che fiancheggiano i segmenti genici V(D)J e porta i segmenti in stretta vicinanza tra loro;alcune esonucleasi recidono poi il DNA all'estremità dei segmenti eliminando i tratti di DNA intercalati e infine delle ligasi riparano le rotture e generano un gene V-J o V-D-J completo.

Il gene riarrangiato viene trascritto e il relativo RNA primario subisce uno splicing che collega il segmento VDJ al primo segmento della regione C ossia Cm.

L'RNA messaggero viene poi tradotto con la produzione della proteina per la catena pesante.

L'epressione della catena leggera (L) Ig segue lo stesso percorso con la differenza che manca delle sequenze D quindi un gene V si ricombina direttamente con un gene J.(V-J) e il gene C è singolo e non determina l'isotipo.

ESPRESSIONE DEI GENI TCR

L'espressione della catena b del TCR segue la stessa via dell'espressione della catena pesante (H) delle Ig.

L'espressione della catena a del TCR manca della sequenza D.

DIVERSIFICAZIONE DEI RECETTORI

Diversificazione combinatoria:si produce grazie alle moltissime combinazioni possibili tra i segmenti genici V,D,J che casualmente si verificano nei diversi cloni di linfociti ,ma è limitata dal numero di segmenti V,D e J disponibili nel genoma.

Diversificazione giunzionale:si esplica grazie a variazioni della sequenza nucleotidica con due meccanismi:

• Al momento del riarrangiamento le esonucleasi possono rimuovere dai segmenti genici V,D e J alcuni nucleotidi:se la ricombinazione avviene senza creare codoni di stop o sequenza non-senso possono generarsi molte nuove sequenze.
• Un enzima detto transferasi deossiribonucleotidica terminale (TdT) può inserire casualmente uno o più nucleotidi nei siti di ricombinazione V(D)J che non erano presenti nei geni in configurazione germinativa.

MATURAZIONE E SELEZIONE DEI LINFOCITI B

Si svolge interamente nel midollo osseo

1. fase pro-b:progenitori destinati allo stipite differenziativo B proliferano sotto l'influsso di IL-7 dando origine a un gran numero di linfociti pro-B
2. fase pre-B:i geni del locus della catena pesante di uno dei due cromosomi si riarrangiano portando alla produzione di catene pesante m che viene espressa in superficie associata con una proteina non polimorfa simile alle catene L formando il recettore pre-BCR:questo recettore non riconosce ligandi,ma stimola la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule su cui è espresso.
3. Fase B immaturo:l'espressione del complesso pre-BCR creato da un cromosoma blocca il riarrangiamento dei geni Ig del secondo cromosoma(esclusione allelica) quindi un linf B può esprimere anticorpi prodotti da uno solo dei due alleli ereditati.In secondo luogo il complesso pre-BCR stimola l'avvia del processo di ricombinazione a livello del locus della catena leggera,prima del locus k ,e poi eventualmente del locus l .Qualunque sia la catena leggera prodotta,questa si associa con la catena pesante m formando il recettore di membrana IgM definitivo che trasmette segnali per la sopravvivenza e la proliferazione dei linfociti che lo esprimono.Se una cellula B immatura lega antigeni self nel midollo osseo con elevata affinità avviene selezione negativa oppure editing del recettore in cui viene riattivata l'espressione della ricombinasi generando una seconda catena leggera e modificando così la specificità del BCR.
4. fase B maturo(vergine):il linf B esprime sia IgM che IgD di membrana poiché l'RNA della catena pesante può subire uno splicing fino al gene Cm o al gene Cd .La capacità dei linfB di rispondere agli antigeni a livello dei tessuti linfoidi periferici presuppone la co-espressione di IgM e IgD.

MATURAZIONE E SELEZIONE DEI LINFOCITI T

I progenitori T migrano dal midollo osseo al timo dove si verifica l'intero processo maturativo.

1. fase pro-T (doppio negativa):sono progenitori immaturi che non esprimono né CD4 ne CD8.tali cellule si espandono numericamente sotto lo stimolo di IL-7 prodotta a livello timico.
2. fase pre-T:parte della progenie doppio negative và incontro a riarrangiamento del gene della catena b del TCR mediato dalla ricombinasi VDJ.La catena b neosintetizzata viene espressa sulla superficie cellulare in associazione ad una catena non polimorfa detta catena pre-Ta formando il complesso pre-TCR che non ha ligandi,ma trasmette comunque segnali per la proliferazione e la sopravvivenza della cellula.
3. fase cellula T immatura(doppio positiva):l'espressione del complesso pre-TCR creato da un cromosoma blocca il riarrangiamento dei geni TCR del secondo cromosoma(esclusione allelica) quindi un linf T può esprimere anticorpi prodotti da uno solo dei due alleli ereditati.In secondo luogo il complesso pre-TCR stimola l'avvia del processo di ricombinazione a livello del locus della catena a. Questa si associa con la catena b formando il recettore di membrana  definitivo che trasmette segnali per la sopravvivenza e la proliferazione dei linfociti che lo esprimono.I linf Timmaturi presentano entrambi i corecettori CD4 e CD8(doppio positivi)
4. fase cell T matura(singolo positivo):i diversi cloni di linfT doppio positivi esprimo TCR ab differenti:se questi recettori non riconoscono o riconoscono ad alta affinità una molecola MHC a livello timico i linf che li esprimono vengono eliminati(selezione negativa).I linf T ristretti per MHC self a bassa affinità(e quindi utili) se riconoscono complessi peptide-MHC di classe I mantengono l'espressione di CD8 e si differenziano in CTL;se invece riconoscono complessi peptide.MHC di classe II mantengono CD4 e si differenziano in Helper