Proteine e trasduzione del segnale

PROTEINE

Struttura

Intelaiatura citoscheletrica, strutture cellulari, impalcatura di sostegno extracellulare

Funzione

Catalisi enzimatica, riconoscimento, trasporto, deposito, movimento, difesa

La struttura delle proteine ne determina la funzione. Strutture primaria, secondaria, terziaria, quaternaria.

Presenza di domini -> motivi particolari

L'omologia delle sequenze suggerisce relazioni funzionali ed evolutive tra le proteine

Chaperonine -> catturano alcune proteine appena formate e le isolano dall'ambiente esterno; gli permettono di raggiungere la configurazione finale e le rilasciano nel distretto idoneo.

Proteine denaturate al calore, con acidi o basi perdono la loro struttura terziaria e secondaria e quindi la funzione biologica --> è un cambiamento reversibile perché sono implicati solo legami deboli che si riformano spontaneamente.

Modificazione degli aa post sintesi --> maggiore varietà delle proteine

metilazione

aggiunta di gruppi -OH

Proteine Coniugate

Glicoproteine: enzimi, Ab, molecole di riconoscimento e recettori, supporti extracellulari

Il gruppo glucidico permette di formare legami idrogeno che stabilizzano le proteine, ne aumentano la solubilità e conferiscono resistenza all'attacco enzimatico; forniscono gruppi specifici, riconoscibili dai ligandi.

Lipoproteine: nelle membrane cellulari, soprattutto nella membrana plasmatica, dove il gruppo lipidico funge da ancora per la proteina.

Metallo proteine: la loro presenza è necessaria per l'attività degli enzimi.

La degradazione delle proteine può avvenire, ad esempio, attraverso la via mediata dall'ubiquitina (Ub) che riconosce delle proteine target che devono essere degradate, le marchia spendendo energia in modo che vengano riconosciute da un secondo sistema enzimatico in grado di degradarle.

Degradazione = rottura dei legami peptidici, irreversibile

Proteine conformate in modo aberrante sono implicate nello sviluppo di patologie:

una placca amiloide nella malattia di Alzheimer è un agglomerato di filamenti proteici che non riesce ad assumere una conformazione funzionale -> diventa insolubile e ostruisce la cellula.

Funzioni proteiche:

la funzione proteica generalmente richiede dei cambiamenti conformazionali

le proteine sono destinate a legare un range di molecole (ligandi)

- il legame è caratterizzato da due proprietà: affinità e specificità

gli Ab posseggono precise specificità di legame

gli enzimi sono catalizzatori molto efficienti e specifici

il sito attivo di un enzima si lega al substrato

Modello chiave-serratura: l'enzima ha già una forma complementare al substrato

Modello ad adattamento indotto: enzima e substrato non sono perfettamente complementari ma quando si incontrano si adattano a vicenda

Sito attivo aperto o chiudo per regolazione dell'attività

Cinetica della reazione enzimatica

-> Curva di saturazione dell'enzima

-> V max

-> Km

Regolazione della funzione proteica (enzimi sempre presenti nella cellula)

Transizioni allosteriche

Rilascio di subunità catalitiche, stato attivo <-> stato inattivo

Legame cooperativo del ligando

Fosforilazione <-> defosforilazione

Attivazione proteolitica -> zimogeni (attivazione per taglio proteolitico)

Compartimentalizzazione

Regolazione allosterica

-> Inibizione a feed-back da prodotto finale

-> Attivazione o inibizione allosterica (con sito allosterico sull'enzima)

-> Rilascio allosterico di subunità catalitiche in presenza di cAMP

Proteine di membrana

Ciascuna membrana cellulare ha un set specifico di proteine che permette alla membrana stessa di svolgere le proprie specifiche attività

Le proteine di membrana sono sia integrali sia periferiche

Le proteine integrali di transmembrana contengono una o più a-eliche transmembrana

Altre proteine integrali sono ancorate alla membrana attraverso catene idrocarburiche legate covalentemente

Le proteine periferiche rimangono legate alla membrana grazie all'associazione con le proteine di membrana

Funzioni: trasporto, linkers, recettori, enzimi

Membrana plasmatica

Funzioni:

o   Assicurare la corretta composizione intracellulare

o   Ricezione dei segnali extracellulari

o   Adesione alla matrice extracellulare e alle cellule adiacenti

-> doppio strato fosfolipidico

-> proteine immerse

-> attraversano completamente la membrana (transmembrana) o ne hanno immersa un'ancora molto profonda (integrali); sono glicoproteine

-> non sono direttamente ancorate alla membrana (periferiche)

La componente proteica delle membrane varia a seconda della funzione della cellula: maggiori sono le funzioni che deve svolgere e maggiore è la concentrazione di proteine presenti.

Fosfolipidi

Coda idrofobica

glicerolo che fa da ponte

Testa idrofilia -> gruppo fosfato + alcol

- Struttura micellare

- A doppio strato molecolare

I due strati della membrana hanno una diversa disposizione dei tipi di fosfolipidi ---> rafts ---> zone specifiche ---> specifici fosfolipidi e specifiche proteine -> trasmettono i segnali all'interno della cellula -> microdomini del foglietto esoplasmatico costituiti da colesterolo e sfingolipidi

Colesterolo: si intercala tra le code dei fosfolipidi e contribuisce a stabilizzare le membrane; se è presente in quantità eccessive irrigidisce la struttura e quindi deve essere altamente regolato.

Proteine di transmembrana

In ogni porzione gli aa che le costituiscono devono essere in grado di interagire con l'ambiente in cui si trovano (polare o non polare); in caso di mutazioni anche piccole la proteina potrebbe risultare per questo completamente alterata.

Proteine integrali

Posseggono una cosa capace di inserirsi nel doppio strato che la ancora alla membrana.

Spostamenti di fosfolipidi nel doppio strato:

- diffusione laterale -> rapida, avviene spesso e facilmente

- diffusione da un foglietto all'altro -> molto lenta, avviene difficilmente e con grande dispendio di energia

Passaggio attraverso la membrana

Passano liberamente i gas, le piccole molecole non cariche, l'acqua (in tempi molto lunghi). Tutto ciò che è carico o di grosse dimensioni da solo non passa.

Trasporto

Passivo

senza consumo di energia

secondo gradiente di concentrazione o elettrochimico

diffusione semplice -> la molecola è in grado di passare il doppio strato fosfolipidico

diffusione facilitata -> avviene secondo gradiente ma richiede un carrier

Attivo

Fornita da ATP (pompe)

richiede energia                            trasportano + di una proteina,

Fornita da gradiente ---->      quella secondo gradiente rilascia E utilizzata per trasporto contro gradiente

avviene contro gradiente

Proteine di trasporto

Pompe: usano l'E ricavata dall'idrolisi dell'ATP per spostare ioni contro il gradiente di concentrazione

Canali: trasportano H₂O o specifici tipi di ioni secondo il gradiente di concentrazione. Le proteine che li compongono formano canali che attraversano la membrana. Sono di solito regolati da stimoli specifici.

Trasportatori: legano ioni o molecole specifiche. Il legame con la molecola trasportata provoca un cambiamento conformazionale -> passaggio

Uniporter -> diffusione facilitata

Symporter + Antiporter -> trasporto attivo

symporter antiporter

Pompe ATPasi

-> P

almeno due subunità (o quattro)

a -> attiva, trasporto

b -> regolazione

es. Na⁺/K⁺

-> F, V

molte subunità

trasportano protoni (H⁺)

F localizzate nei mitocondri: fanno entrare secondo gradiente gli H⁺ e usano l'energia così ricavata per generare ATP

V localizzate nelle vescicole (lisosomi ed endosomi): abbassano il pH pompando H⁺ all'interno delle vescicole

-> ABC

trasportano molte sostanze

buttano fuori una serie di sostanze dannose alle cellule (compresi i chemioterapici)

Pompa Na⁺/K⁺

Mantiene la ddp a cavallo della membrana

Nel citoplasma ci deve essere un'elevata concentrazione di K⁺ e una bassa concentrazione di Na⁺

Necessita di ATP -> ad ogni trasporto butta all'esterno 3 Na⁺ e all'interno 2 K⁺ per ogni ATP

Meccanismo: sito per l'ATP più tre siti ad alta affinità per Na⁺ e due siti con bassa affinità per K⁺ in condizioni di riposo. L'ATP fosforica la proteina e ne modifica la struttura. Essa si capovolge (o apre canali) e si ritrova con i siti di legame all'esterno della cellula. L'affinità dei siti cambia permettendo di rilasciare Na⁺ e catturare K⁺. Il gruppo fosfato viene staccato, la proteina si ribalta nuovamente, il K⁺ viene liberato e si ritorna alla situazione di partenza.

Pompa Ca⁺⁺

Mantiene bassa la concentrazione di calcio nel citoplasma perché questi ioni sono dei secondi messaggeri e si trovano racchiusi all'interno del REL

La proteina ha due siti ad alta affinità per il Ca⁺⁺ rivolti verso il citoplasma, gli ioni si legano, l'ATP fosforica, la pompa si ribalta, si libera Ca⁺⁺, si stacca il gruppo fosfato, la proteina si rigira.

Pompa F

Trasporta 3 H⁺ attraverso un canale (secondo gradiente) -> sviluppa energia che viene recuperata sottoforma di ATP.

Pompa ABC

Presenta due regioni idrofobiche transmembrana e due regioni idrofiliche citoplasmatiche che legano l'ATP.

Sono localizzate:

nei batteri -> nella membrana plasmatici dove trasportano aa, zuccheri e peptici

negli eucarioti

nel reticolo endoplasmatico dove trasportano peptici per la presentazione antigenica

nella membrana plasmatici dove trasportano piccole molecole, fosfolipidi e farmaci con struttura simile ai lipidi

Meccanismi possibili:

prende la sostanza presente sul versante citoplasmatico, la lega, si rovescia e libera la sostanza

apre un canale che permette il passaggio della sostanza senza il ribaltamento

Sono presenti in grande quantità nel fegato -> la sostanza tossica arriva al fegato, viene detossificata ed escreta con la bile

MDR

Canali -> fori nella membrana

All'esterno del canale c'è la presenza di aa non polari ma nel centro del canale aa polari per permettere il passaggio di sostanze polari (grazie a ripiegamenti della catena). Normalmente il canale è chiuso

-> ripiegamento della catena a formare un tappo che chiude il canale; per aprirlo avvengono delle modificazioni della catena

-> regolazione tramite il voltaggio: fila di aa carichi + che tendono a stare verso la parte della proteina che guarda verso il citoplasma -> tengono chiuso il canale. Depolarizzazione -> si spostano verso l'esterno e aprono il canale

-> regolazione con neurotrasmettitore che, legandosi al sito di legame, apre il canale

Aquaporine -> canali selettivi che permettono solo il passaggio dell'acqua; sono presenti nelle zone dove c'è necessità di un grosso riassorbimento (rene, polmone, ghiandole salivari e lacrimali, SNC)

Il glucosio passa dalle cellule epiteliali al sangue grazie a degli uniporter, all'apertura di questi canali.

Saturazione

Diffusione semplice

Diffusione facilitata

Nell'assorbimento intestinale, invece, il glucosio passa attraverso symporter

Sangue                        Cellule epiteliali Lume intestinale

GLU GLU

uniporter GLU

Na⁺       Na⁺

ATP

2 Na⁺ 2 Na⁺

ADP + Pi

K⁺                            K⁺

Na⁺/K⁺ ATPasi Symporter

CITOSCHELETRO E FORME DI GIUNZIONE INTERCELLULARE

Proteine coinvolte

Actina

- una delle proteine più abbondanti della cellula

- monomero G-actina, polimero F-actina

- ogni monomero contiene uno ione Mg2+ complessato con ATP o ADP

- la G-actina polimerizza a formare F-actina in presenza di ioni divalenti, ma questo fenomeno è reversibile

- durante la polimerizzazione l'ATP viene idrolizzato, ma questo influenza solo la velocità di reazione

La G-actina viene assemblata in lunghi polimeri elicoidali di F-actina. Le subunità di G-actina sono orientate tutte allo stesso modo. Si definisce estremità - quella in cui il sito per l'ATP è a contatto con il citosol. Costituisce filamenti. Le proteine cross- linking si mettono a ponte tra i filamenti di actina -> struttura stabile ma reversibile adatta a costituire il citoscheletro. Il network di actina può essere in connessione con le proteine plasmatiche.

Miosina

Hanno testa, collo e coda. La testa aiuta nel movimento interagendo con i filamenti di actina; la cosa ancora la miosina.

L'ATP si associa alla testa e provoca il distaccamento dal filamento di actina -> la testa si sposta e si aggancia in un altro punto -> l'ATP viene idrolizzato -> il distaccamento del gruppo fosfato provoca un movimento nella testa -> l'ADP viene rilasciato e si torna alla situazione di partenza

Microtubuli

polimeri di subunità globulari (tubulina) con forma tubulare

eterodimero di a e b tubulina; ognuna delle due subunità lega una molecola di GTP

a lega GTP in maniera irreversibile, b idrolizza GTP in GDP

a GTP si trova all'interno del dimero, b GTP si trova in superficie per consentire lo scambio tra GDP e GTP

Costituiscono ciglia e flagelli (due) e cetrioli (tre). Quest'ultimi vanno a costituire il centro di controllo dei microtubuli -> organizzano la gestione dei microtubuli all'interno della cellula. Sono importanti anche nella formazione del fuso mitotico.

Assemblaggio e disassemblaggio avvengono preferenzialmente all'estremità +. Prima viene assemblato il protofilamento

I microtubuli servono anche per i movimenti di vescicole ed organelli.

Chinesine e dineine

fanno da ponte tra il microtubuli e la vescicola che viene trasportata

le chinesine muovono verso l'estremità + dei microtubuli (trasposto anterogrado), le dineine verso l'estremità -

ogni tipo di vescicola è trasportata da una chinesina specifica, specificità determinata dalla coda della chinesina

le dineine si legano ai loro carichi mediante proteine adattatrici

chinesine -> meccanismo attacco-stacco

Microtubuli e mitosi

-> ottenere una corretta separazione dei cromosomi:

i microtubuli si attaccano al cinetocore del cromosoma

Cinetocore = proteine specifiche con piastra interna (DNA) e piastra esterna (microtubuli)

Adesione fra cellule e fra cellule e matrice

I filamenti intermedi intervengono nella giunzione cellula-cellula; sono importanti per la formazione dei vari organi -> sono diversi a seconda dell'organo e sono coinvolte nel processo di riconoscimento tra cellule di diversi organi.

Proteine di transmembrana -> all'interno della cellula sono legate ai microtubuli

Tight junctions

Giunzioni strette con necessità di Ca²⁺; E. coli è in grado di aprirle

Presenti in serie

Zona aderente

-> caderine

costituiscono i desmosomi -> filamenti di cheratina (citoscheletro)

Gap junction -> canali tra una cellula e l'altra

-> connessine

- caderine -> legano solo tra di loro

-> coda citoplasmatica, a nella membrana strutturale esterna

-> presenza di Ca²⁺

-> mediano l'adesione omofilica Ca²⁺ dipendente

- cam (neural - cell adhesion molecules) -> molecole di adesione cellulare

-> IgG

-> mucina

-> molecole per l'adesione cellulare Ca²⁺ indipendente

Il loro ruolo nel determinare l'adesione è meno importante delle caderine. Possono non avere l'ancoraggio al di sotto del citoscheletro ma essere ancorate con code lipidiche

selectine

Possono intervenire nella migrazione dei leucociti

- integrine -> giunzione tra cellule e matrice extracellulare -> si attaccano sia dentro sia fuori la cellula con filamenti

interno                        esterno

adesioni focali                       actina fibronectina

esmodesmosomi        cheratina laminino

Gap junction

Canali selettivi per le dimensioni fino a 1000 Dalton

Importanti per la risposta sincrona da più cellule

Connessori costituiti da sei connessine -> ogni cellula forma metà canale

Regolazione: possono essere chiuse per evitare di trasferire sostanze tossiche -> >>Ca²⁺ <<pH -> segno di morte imminente della cellula

Mutazioni delle connessine:

responsabili della sordità -> dominante o recessiva

Malattia di Charcot-Marie-Tooth, neuropatia demielinizzante del sistema nervoso centrale e periferico

Membrana cellulare

"Signaling" cellula-cellula

Sintesi e rilascio del segnale dalla cellula produttrice

Trasporto alla cellula "target"

Ricezione del segnale da parte della cellula "target" (recettori)

Traduzione del segnale all'interno della cellula "target" (da recettori ad altre proteine)

Risposta cellulare

Segnale endocrino: secrezione di un ormone che fa avvenire una risposta da cellule distanti

Segnale paracrino: secrezione e rilascio dell'ormone nello spazio extracellulare; risposta delle cellule vicine

Segnale autocrino: la cellula produttrice è la cellula target -> feed-back

Segnale della membrana plasmatica: attraverso le giunzioni

Recettori intracellulari situati a livello del citoplasma -> la molecola che li colpisce attraversa liberamente la membrana -> ormoni steroidei

Azione a livello del nucleo della cellula -> sintesi di proteine -> agisce sul nucleo facendo copiare in mRNA una determinata sequenza genica -> sintesi (o inattivazione della sintesi)

Caratteristiche della risposta recettoriale

Interazione del ligando (ormone, fattore di crescita, neurotrasmettitore) con un recettore posto sulla superficie cellulare

Vie di risposta interna simili con diverse caratteristiche in comune (protein-chinasi -> fosforila)

Svariate proteine bersaglio dell'attività protein-chinasica (enzimi del metabolismo, proteine trasportatrici, proteine regolatrici)

A inattiva       -----> A attiva

B attiva           -----> B inattiva

Protein-fosfatasi -> defosforilano

Recettori situati sulla superficie

a) Accoppiati a proteine G

Ligando -> si lega al recettore -> attiva la proteina G -> agisce su altre proteine che generano un secondo messaggero ed, essendo molto piccole, diffondono -> i secondi messaggeri trasferiscono l'informazione all'interno della cellula (Ca²⁺)

b) Ioni canale

Ligando -> si lega al recettore -> permette l'apertura del canale -> passaggio di ioni

c) Recettori legati a tirosin-kinasi (fosforilano dove c'è la tirosina)

Recettore costituito da due subunità poste in vicinanza ma inattive e tirosin-kinasi inattive -> il ligando si mette a ponte tra le due subunità -> il recettore dimerizza -> attivazione della kinasi -> fosforilazione delle proteine -> attivazione o inibizione

d) Recettori con attività enzimatica intrinseca

Ligando -> si lega al recettore -> la parte intracitoplasmatica:

1) funge da enzima -> trasforma GTP in cGMP (secondo messaggero)

2) ha funzione chinasica -> fosforila

a) G-proteins

Proteine costituite da tre subunità:

-> lega ed idrolizza il GTP

a -> sito attivo

-> attiva le proteine a valle -> adenilato ciclasi (trasforma l'ATP in cAMP)

b g -> ancorano la proteina G alla membrana (tramite g) e mantengono inattiva la catena a

Esistono anche proteine G inibitorie

a -> lega ed idrolizza il GTP, inibisce l'adenilato ciclasi

G-protein attivante la fosforilasi C-b che trasforma dei fosfolipidi di membrana in secondi messaggeri

Il recettore che attiva la proteina G è costituito da:

-> una parte esterna che lega il ligando

-> dei domini transmembrana

-> una zona interna che va ad interagire con la proteina G

Avviene un cambiamento conformazionale del recettore ad opera del ligando che modifica la struttura della zona intercellulare -> attivazione della proteina G si sostituisce GDP con GTP -> distacco delle subunità b e g -> attivazione dell'adenilato ciclasi -> ATP -> cAMP + ppi

Tutte queste molecole sono presenti in un raft lipidico

Successivamente la subunità a idrolizza il GTP -> si riforma la struttura trimerica -> viene bloccata l'attività della subunità a

L'adenilato ciclasi ha prodotto l'AMP ciclico che attiva l'A-kinasi (presente nel citoplasma o legata alla membrana) -> protein-kinasi dipendente dal cAMP presente in forma inattiva grazie a subunità regolatorie alle quali si lega l'cAMP -> le subunità si staccano -> si attiva la protein-kinasi A -> va nel nucleo a fosforilare proteine che regolano la trascrizione dei geni

Può attivare un ligando che attiva un recettore che, a sua volta, attiva una proteina G inibitoria sullo stesso adenilato ciclasi.

Ligandi di questa cascata -> glucagone, ACHT, eparina

-> ad es. rilascio glucosio

Secondi messaggeri: cAMP, cGMP, 1,2-diacilglicerolo (DAG), inositolo 1,4,5-trifosfato (IP₃), Ca²⁺

DAG (idrofobica) e IP₃ (idrofilica) sono costituenti dei fosfolipidi

La fosfolipasi C agisce su un fosfolipide di membrana spaccandolo in due:

la fostatidilinositolo kinasi fosforila in posizione 4, poi 5 (1 a ponte con glicerolo)

la fosfolipasi può funzionare -> diacilglicerolo che resta nella membrana

-> IP₃ che va nel citoplasma

IP₃, nel citoplasma, agisce su canali specifici a livello del REL, aprendoli, il Ca²⁺ immagazzinato nel REL passa nel citoplasma secondo gradiente di concentrazione

-> fuoriuscita di Ca²⁺ nel citoplasma

Attiva la Pkc e provoca un suo spostamento verso la membrana plasmatica dove interagisce con il DAG

L'attivazione di Pkc avviene attraverso

La liberazione di ioni calcio (C₂)

Il suo movimento verso la membrana

L'interazione con DAG (C_1A - C_1B)

DAG va ad interagire sulla cascata delle MAP kinasi va ad agire a livello nucleare provocando la trascrizione di determinati geni

Fosfolipasi A2 -> interviene nel ciclo dell'ac. arachidonico che è un precursore dei mediatori dell'infiammazione (convertito tramite lipo ossigenasi o ciclo ossigenasi in mediatori dell'infiammazione gli antinfiammatori non steroidei agiscono su questi due enzimi ) -> agisce sulla Pkc, sulla fosfolipasi C e sulla liberazione di ioni calcio.

Le citochinine hanno un ruolo essenziale nei processi infiammatori e nella risposta immunitaria.

Il calcio liberato va ad interagire con la calmodulina -> può legare al massimo 4 ioni calcio -> il legame provoca un cambiamento conformazionale della proteina, attivandola -> in grado di legare (e quindi attivare) la cAMP fosfodiesterasi, un enzima che degrada il cAMP -> "spegne" il segnale -> meccanismo di controllo -> azione contraria rispetto all'adenilato ciclasi -> INSERZIONE TRA LE DUE VIE

Ossido nitrico (NO) -> prodotto secondario derivato dalla conversione dell'L-arginina in L-citrullina da parte di enzimi chiamati nitric oxide sinthase (NOS)

Arginina + O2 -NOS-> citrullina + NO

n NOS neuronale   produzione di

e NOS endoteliale (tono dei vasi)           NO costante

i NOS inducibile (infiammazione) poco espresso, dopo stimolo

Azione intracellulare di NO

attivazione di fattori trascrizionali (proteine che agiscono sul DNA)

interazione con proteine contenenti Fe -> emoglobina, proteine della catena di trasporto degli e^-

legame con radicali liberi

La calmodulina si va a legare anche al NOS -> produzione di NO -> nelle cellule endoteliali -> diffonde nelle cellule muscolari lisce che regolano il tono dei vasi -> agisce sulla guanilato ciclasi (che contiene Fe) -> da GTP a cGMP

Recettori che si legano a proteine che hanno attività kinasica

Recettore costituito da due subunità -> il ligando lo dimerizza -> attivazione Pk che vanno a fosforilare lo stesso recettore a cui sono state legate (l'altra subunità del recettore) -> nella sua porzione intracitoplasmatica. Alla zona fosforilata si vanno ad attaccare degli adattatori -> ponte tra recettore e proteine che attiveranno la cascata a valle.

Domini degli adattatori

SH₂ -> consente il legame alle tirosine fosforilate

SH₃ -> interagisce con altre proteine per la trasduzione del segnale

Gli adattatori vanno ad interagire con RAS che, se è legato con GTP è attivo, con GDP è inattivo; esso agisce attraverso le MAP kinasi ed è stato il primo oncogene scoperto (se mutato).

GAP -> GTPase activactina protein -> stimola l'idrolisi di GTP

GNRP (GEF) -> Guanine nucleotide releasing protein -> fa rilasciare GDP da RAS

In condizioni patologiche RAS non è in grado di idrolizzare GTP -> la cascata successiva porta alla duplicazione cellulare -> se patologica -> tumori

Differenti recettori possono concorrere attraverso vie diverse per arrivare allo stesso scopo.

I fattori di trascrizione possono anche essere presenti nel citoplasma -> in forma inattiva che una volta attivati da una kinasi migrano nel nucleo.