Genetica molecolare dei procarioti e dna ricombinante

GENETICA MOLECOLARE DEI PROCARIOTI E DNA RICOMBINANTE

IL CROMOSOMA DI E. COLI

Il cromosoma di E. Coli è formato da una sola catena continua di DNA a doppio filamento. All'intermo della cellula il cromosoma è compattato dentro una struttura di forma irregolare detta nucleotide. Il cromosoma batterico circolare quando si duplica forma una struttura che assomiglia alla lettera θ (theta) ed è detta duplicazione theta.

TRASCRIZIONE E SUA REGOLAZIONE

Un segmento di DNA che codifica per un polipeptide (una proteina) è noto come gene strutturale. Spesso i geni strutturali che codificano per polipeptidi con funzioni correlate lavorano in sequenza, e sono trascritti in un singolo filamento di mRNA.

L'operone

Secondo il modello dell'operone gruppi di geni che codificano per proteine con funzioni correlate sono assemblati in unità dette operoni. Un operone comprende il promotore, i geni strutturali e un'altra sequenza di DNA detta operatore.

L'operatore è una sequenza di nucleotidi posta fra il gene promotore e i geni strutturali; l'operatore può sovrapporsi al promotore, al gene strutturale adiacente o ad entrambi.

La trascrizione dei geni strutturali è controllata dall'attività di un altro gene, il regolatore. Questo gene codifica per una proteina detta repressore che si lega all'operatore. Quando un repressore è legato all'operatore ostacola il promotore, di conseguenza l'RNA polimerasi non può legarsi alla molecola di DNA quindi non si verifica alcuna trascrizione dell'mRNA. Se il repressore viene rimosso la trascrizione può iniziare.

PLASMIDI E CONIUGAZIONE

Tutti i batteri contengono molecole di DNA chiamate plasmidi. I plasmidi possono contenere da 2 a 30 geni e possono entrare o uscire dal cromosoma batterico, un plasmidi incorporato nel cromosoma viene detto episoma.

I plasmidi sono circolari e autoduplicanti, alcuni plasmidi si duplicano in sincroniacon il cromosoma e ogni cellula figlia riceve solo una copia del plasmide; Altri plasmidi si duplicano in modo asincrono, col risultato che le cellule possono contenerne copie multiple.

Il plasmide F (2 cose)

Questo fattore F, o plasmide F contiene geni che controllano la produzione dei pili F. I pili F sono lunghe strutture proteiche a forma di bastoncino che si estendono dalla superficie della cellula contenente il plasmide F, nota come cellula maschio (donatore) o F⁺. La cellula priva del plasmide F è detta cellula femmina (ricevente) o F^-.

Le cellule F⁺ possono attaccarsi alle cellule F^- per mezzo dei pili e trasferire loro il plasmide F, questo fornisce alle cellule riceventi la capacità di produrre pili F e di trasferire il fattore F.

Il trasferimento da una cellula a un'altra mediante il contatto cellula-cellula è detto coniugazione.

VIRUS

I virus sono costituiti da una molecola di acido nucleico racchiusa in un involucro nucleico detto capside. Essi possono spostarsi da cellula a cellula e possono utilizzare il suo apparato enzimatico e i suoi organuli per duplicare il proprio acido nucleico e per sintetizzare nuovi involucri proteici.

I virus sono dei parassiti obbligati essi non possono riprodursi fuori dalla cellula.

Il ciclo infettivo è completo quando le molecole di acido nucleico virale vengono avvolte in nuovi involucri proteici e le particelle virali fuoriescono dalla cellula ospite.

Trasduzione

La trasduzione consiste nel trasferimento di DNA cellulare da una cellula ospite ad un'altra per mezzo di virus.

Durante il ciclo litico di molti virus, il DNA dell'ospite si frammenta; quando questi virus abbandonano la cellula, molti possono contenere frammenti di DNA del cromosoma ospite. I geni portati via agli ospiti precedenti possono venir incorporati nel cromosoma della nuova cellula ospite.

TECNICHE DEL DNA RICOMBINANTE

Le principali tecniche del DNA ricombinante sono:

1. i metodi per ottenere specifiche sequenze uniformi di DNA
2. la clonazione del DNA, che rende possibile la produzione di tali segmenti di DNA in gran numero
3. l'ibridazione dell'acido nucleico, ossia un metodo per identificare specifici segmenti di DNA e RNA e per individuare le somiglianze tra gli acidi nucleici di diversa origine
4. la sequenzazione del DNA, ossia la determinazione dell'esatto ordine dei nucleotidi in un segmento di DNA

Isolamento di specifici segmenti del DNA

Gli strumenti sono gli enzimi di restrizione, utilizzati da certe cellule batteriche, e da un altro enzima, la transcriptasi inversa, che è codificata dall'acido nucleico di certi virus a RNA.

Enzimi di restrizione

La funzione di questi enzimi è quella di tagliare il  DNA estraneo.

La caratteristica principale è che essi non tagliani il DNA a caso, ma solo presso sequenze nucleotidiche specifiche. Queste sequenze sono dette sequenze di riconoscimento, i batteri proteggono il DNA dai loro enzimi di restrizione aggiungendo un gruppo metile (-CH₃) ad uno o più nucleotidi delle sequenze di riconoscimento del loro DNA. Questa mutilazione è realizzata da speciali enzimi che si trovano abbinati agli enzimi di restrizione.

Una seconda caratteristica degli enzimi di restrizione è che non tutti possono fare tagli netti attraverso i due filamenti della molecola di DNA; alcuni, come EcoRI, tagliamo i filamenti con lo scarto di alcuni nucleotidi, lasciando delle estremità coesive (sticky) ai lati. Queste estremità possono unirsi con un altro segmento di DNA tagliato dallo stesso enzima di restrizione, il quale, come risultato mostra unità coesive complementari. I frammenti di DNA prodotti dagli enzimi di restrizione che agiscono sul DNA di una cellula sono detti DNA genomico.

Transcriptasi inversa e oligonucleotidi sintetici

Nel caso di virus al DNA,  il DNA virale viene sia duplicato per formare altro DNA virale sia trascritto in RNA messaggero per dirigere la sintesi delle proteine virali.

Alcuni virus a RNA hanno un metodo di duplicazione differente: in questi virus l'RNA serve come stampo per sintetizzare il DNA, utilizzando un enzima virale, la transcriptasi inversa.

Il DNA sintetizzato per mezzo della transcriptasi inversa da uno stampo di RNA è detto DNA copia, o cDNA. Le molecole di cDNA possono essere inserite in altre molecole di DNA per mezzo di estremità coesive artificiali.

Il vantaggio di utilizzare la transcriptasi inversaper produrre segmenti di DNA è che le molecole di cDNA rappresentano geni invece che frammenti prodotti dagli enzimi di restrizione.

Lo svantaggio è che è necessario isolare una specifica molecola di mRNA dalla quale può essere trascritto il cDNA.

Esiste un terzo metodo per sintetizzare brevi sequenze di DNA ed RNA. Queste molecole sono dette oligonucleotidi sintetici e vengono assemblate con particolari tecniche mettendo uno dopo l'altro i nucleotidi della sequenza desiderata.

Cloni e vettori

Si aveva bisogno dei vettori che potessero trasportare le molecole di DNA in esame

Plasmidi e lambda come vettori

Il plasmide pSC101 ha una sola sequenza GAATTC in tutta la sua molecola ed è tagliato da EcoRI soltanto in un sito.

Il plasmide si duplica diverse volte nella sua cellula ospite, producendo circa 10 nuovi plasmidi per cellula.

La scoperta che pSC101 poteva essere usato come vettore di DNA estraneo aprì la strada alla produzione di segmenti di DNA uniformi e identici. Tali copie multiple sono dette cloni.

I plasmidi che si riproducono più velocemente sono avvantaggiati dal punto di vista evolutivo. Più grande è un plasmide più tempo esso impiega a riprodursi.

Per poter clonare segmenti di DNA lunghi fino a 20000 coppie di basi azotate si usano ceppi di batteriofagi lambda modificati. A questi fagi viene rimossa la sezione centrale del DNA, che viene sostituita con un analogo frammento del DNA estraneo che si vuole clonare.

Ibridazione dell'acido nucleico

Se si scalda lentamente del DNA, i legami ad idrogeno che tengono uniti i due filamenti si spezzano e i filamenti si separano; la struttura tridimensionale si modifica e la molecola è detta denaturata. Quando poi la soluzione viene raffreddata, i legami a idrogeno si riformano, ricostruendo la doppia elica.

Quando vengono mescolati dei DNA presi da fonti diverse, essi subiscono delle collisioni casuali e se si incontrano due filamenti con sequenze molto simili si forma una doppia elica ibrida.

Quando del DNA denaturato è mescolato con dell'RNA a filamento singolo si possono formare degli ibridi DNA-RNA.

Sequenzazione del DNA

La scissione di una molecola di DNA con un enzima di restrizione produce un gruppo particolare di brevi frammenti di DNA; la scissione di una molecola di DNA identica mediante un differente enzima di restrizione produce un differente gruppo di frammenti di DNA.