Coltivazione dei microrganismi

COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI

I batteri, che sono i microrganismi più diffusi nella biosfera (complesso degli organismi viventi che utilizzano l'ambiente fisico in cui vivono) e quelli di maggiore importanza medica, possono essere coltivati agevolmente con opportune tecniche (terreni di coltura), che consentono la riproduzione sia delle forme microbiche saprofitarie (che si nutrono a spese di organismi morti o in generale di sostanze organiche in decomposizione) sia di quelle parassite (organismi che vivono a spese di altri, stabilendosi nell'interno o alla superficie del loro corpo). I mezzi di coltura, che sono idonei per la coltivazione oltre che dei batteri anche dei funghi, sono in genere costituiti da brodi nutritivi formati da composti chimici indispensabili alla loro sopravvivenza e riproduzione (vitamine, sostanze organiche, sali, ecc.)

TERRENI DI COLTURA PER BATTERI

Per poter coltivare i batteri in laboratorio occorre utilizzare degli idonei mezzi i coltura, comunemente detti terreni. Questi sono costituiti da materiali nutritivi in grado di riprodurre artificialmente, in laboratorio, l'ambiente che può soddisfare le esigenze metaboliche del batterio. Precondizione necessaria è che i terreni siano sterili (ovvero privi di microrganismi) prima della semina con uno specifico batterio. È allora indispensabile che tutte le operazioni che portano alla preparazione dei terreni siano condotte con tutte le accortezze in grado di evitare la contaminazione, da parte di germi estranei, del terreno che dovrà essere seminato.

STATO FISICO.

I terreni di coltura possono essere distinti in solidi e liquidi sulla base del loro stato fisico. Per poter solidificare un terreno liquido occorre aggiungervi l'Agar, un polisaccaride acido estratto da alghe rosse, che non risulta tossico per i batteri e non viene da questi attaccato enzimaticamente.

L'aggiunta di Agar, disciolto a caldo a temperature superiori agli 80°C, nella proporzione dell'1.5% ad un terreno liquido ne determina la gelatificazione (solidificazione), con formazione di una superficie abbastanza solida da consentire varie manipolazioni, abbastanza umida da permettere la replicazione dei batteri ma non troppo liquida da far muovere liberamente i batteri flagellati. Un terreno solidificato con Agar può tornare liquido a temperature superiori agli 80°C e si risolidifica se la temperatura scende sotto i 45°C.

COMPOSIZIONE CHIMICA.

I terreni di coltura sono substrati forniti di sostanze nutritive che permettono la crescita dei batteri in laboratorio. I terreni di base in batteriologia, ed in particolare in quella medica, utili per coltivare batteri che non presentano particolari esigenze nutritive sono: brodo-normale e agar-normale (o brodo normale solidificato con agar).

Il brodo-normale è il terreno di coltura liquido fondamentale in batteriologia, in quanto rappresenta la base per l'allestimento di altri terreni specifici (per es. agar-normale). è costituito da una soluzione allo 0.5% di peptoni (sostanze solubili che derivano dalla digestione enzimatica o autolitica della carne) arricchita con lo 0.3% di estratto di carne, la soluzione viene poi portata all'isotonicità aggiungendo cloruro di sodio, filtrata e portata a pH neutro o leggermente alcalino mediante fosfatasi. Lo sviluppo dei batteri in terreni liquidi viene evidenziato dall'intorbidamento del terreno che varierà a seconda della specie che si è sviluppata: intorbidamento a fiocchi, a granuli, uniforme, diffuso su tutto il terreno, oppure solo agli strati superficiali. L'agar-normale è il terreno di coltura solido per eccellenza. Si ottiene addizionando ad un brodo- normale l'1.5% di agar. La caratteristica dell'agar normale è, oltre la limpidezza, la sua capacità di sciogliersi se riscaldato sopra gli 80°C e poi di risolidificare al di sotto dei 45°C. Queste caratteristiche consentono di versarlo ancora liquido in matracci, provette o, di norma, in piastre di Petri e di lasciarlo raffreddare e solidificare. I terreni solidi sono in grado di offrire i migliori vantaggi in batteriologia: in essi è possibile la coltivazione di batteri in colonie isolate, che meglio consentono l'identificazione dei batteri e la loro conservabilità in laboratorio. I terreni di coltura devono essere costituiti tenendo conto del pH ottimale per la crescita della specie batterica che si desidera coltivare.

Ai terreni di base vengono aggiunti di volta in vota, in base alle esigenze nutritive del batterio che occorre coltivare, altri materiali quali sangue, siero, estratto di lievito, estratto di tessuti animali o vegetali, ecc. Il brodo-normale con aggiunta di componenti come sangue, siero, ecc. costituisce un terreno di arricchimento in grado di favorire lo sviluppo dei batteri eterotrofi particolarmente esigenti che si vogliono isolare rispetto ai batteri contaminanti. I terreni possono essere resi selettivi e differenziali. Sono resi selettivi con aggiunta di opportune sostanze in grado di svolgere azione di batteriostasi verso tutti i batteri, fatta eccezione per quello che si desidera coltivare, che viene quindi ad essere favorito nello sviluppo. Sono invece differenziali se si aggiungono sostanze ed indicatori per es. di pH (terreni indicatori) in grado di rilevare peculiari attività metaboliche (ad es. fermentative o enzimatiche) che si verificano nel terreno in seguito alla crescita della specie batterica studiata, e consentono perciò di differenziare per es. nell'ambito del genere le varie specie di appartenenza.

PRINCIPALI OPERAZIONI PER LA PRPARAZIONE DEI TERRENI.

a) Pesata degli ingredienti.

normalmente possono essere tollerati errori nell'ordine di milligrammi o anche centigrammi o perfino decigrammi; talvolta invece la pesata deve essere molto precisa come per i fattori di crescita nei terreni sintetici o per gli inibitori nei terreni selettivi.

Prima di pesare, leggere attentamente la formula del terreno ed attenersi  strettamente alla natura esatta dei prodotti da usare che può avere un'importanza fondamentale.

b) Dissoluzione degli ingredienti:

si fa sempre in acqua che è indispensabile alla vita dei batteri. Si usa acqua distillata, la dissoluzione deve essere fatta in recipienti di vetro. Il calore favorisce e talvolta è indispensabile per sciogliere completamente alcuni terreni. In ogni modo è bene limitare il riscaldamento allo stretto necessario; l'ebollizione prolungata è nociva e deve essere quindi evitata.

c) Aggiustamento del pH:

questa operazione è molto importante perché molti batteri non possono moltiplicarsi in condizioni di alcalinità o acidità esagerata. La misura del pH si effettua col potenziometro o per mezzo di indicatori colorati. Per portare il terreno alla neutralità si aggiunge dell'acido cloridrico 1/20 se il pH è superiore a 7 o a una soluzione diluita di carbonato o di idrato di sodio se è inferiore a 7, queste aggiunte devono essere effettuate goccia a goccia mescolando continuamente il terreno e ogni tanto misurando nuovamente il pH. Il pH varia con le temperatura e deve essere quindi misurato a temperature non superiori ai 50°C.

d) Sterilizzazione dei terreni e incubazione delle colture.

Sia i terreni colturali prima di essere seminati con specie batteriche, sia i recipienti che li ospiteranno, devono essere resi sterili e cioè assolutamente privi di ogni forma di vita. Il metodo più usato e che fornisce le migliori garanzie è l'autoclavatura del terreno e dei recipienti. A questo fine viene  utilizzata l'autoclave, un apparecchio costituito da un grande recipiente metallico in cui viene fatto formare vapore sottopressione in grado di determinare temperature sterilizzanti. Quando il vapore saturo interno raggiunge la pressione di una atm, la temperatura si eleva a 121°C, e questi valori sono sufficienti a sterilizzare in tempi brevi (circa 15-20 min.) i terreni posti all'interno in provette e matracci chiusi con tappi di cotone, chiusure che consentono la permeazione del vapore ma evitano l'inquinamento microbico delle colture.

Una volta sterilizzato e seminato il terreno, perché la coltivazione abbia successo occorre dare al terreno anche l'ambiente adatto alle esigenze del batterio: esso dovrà essere posto in incubazione a temperature stabilite e costanti in stufe termostatate. Ciascuna specie batterica ha un proprio optimum di temperatura che ne favorisce la crescita e la moltiplicazione; in genere i batteri patogeni sono mesofili, hanno cioè un optimum di temperatura di ca. 36°C, mentre i batteri psicrofili di 20°C e quelli termofili di 56°C. Il terreno verrà quindi messo in termostato alla temperatura ideale per un tempo ottimale che per la maggioranza dei batteri è di 48 ore (incubazione delle colture). L'incubazione in termostato per alcune specie batteriche può prolungarsi ben oltre le 48 ore.