MICOBATTERI

Bacilli

CARATTESISTICA TINTORIALE DELL'ACIDO-RESISTENZA

Involucri esterni caratteristici: come nei Gram +, la cellula micobatterica presenta all'esterno della membrana cellulare uno strato di peptidoglicano. Il peptidoglicano è ricoperto, verso la superficie cellulare esterna, da una complessa struttura ricca di carboidrati e di lipidi; essa è formata da arabino-galattani che legano al peptidoglicano una serie di acidi grassi "acidi micolici" cui sono legate una serie di molecole di glicolipidi fenolici. La struttura è attraversata da altre molecole glicolipidiche ancorate alla membrana cellulare.                                              Le strutture periferiche dei micobatteri, rendono la cellula impervia ad una vasta serie di sostanze potenzialmente dannose. Da tale caratteristica dipende la proprietà tintoriale dell' "acido-resistenza" dei micobatteri, infatti, tali batteri (anche fissati =uccisi) sono difficilmente penetrabili dai coloranti usanti in batteriologia, che devono essere fatti agire in soluzioni concentrate e a temperature elevate 75-80° C. Dipendente dalla struttura degli involucri esterni è il rallentamento degli scambi selettivi di nutrienti e altre molecole con l'ambiente, e inoltre il lungo periodo di duplicazione cellulare.

Colorazione micobatteri, metodo di colorazione di Ziehl-Neelsen:

si tratta il preparato x 2-3 min con una soluzione di fucsina addizionata di acido fenico, riscaldando il vetrino fino che la soluzione del colorante emetta dei vapori visibili;

lavare con acqua

decolorare x 30-60 secondi con una soluzione di HCl al 3% in alcool etilico

eseguire una colorazione di contrasto con blu di metilene

Solo i micobatteri mantengono in colorante rosso della fucsina dopo il trattamento, mentre tutti gli altri materiali vengono decolorati e sono ricolorati in blu. I micobatteri sono apprezzabili come bacilli rossi in campo blu. L'acido-resistenza è dovuta alla formazione di aryl-metano.micolati tra fucsina e gli acidi micolici.

TERRENI DI COLTURA ARTIFICIALI

Le strutture periferiche dei micobatteri rendono la cellula impervia ad una serie di sostanze potenzialmente dannose (basi e acidi minerali forti). Gli scambi metabolici con l'ambiente sono rallentati, e ciò è legato anche ad un ritmo di moltiplicazione assai lento (sviluppo microbico in coltura primaria è apprezzabile solo dopo 3-4 settimane di incubazione a 37°C

Le esigenze nutrizionali possono essere soddisfatte con numerosi terreni, la > parte si possono coltivare su terreni abiotici, con un'eccezione x Mycobacterium lepre che non è coltivabile in vitro.

I terreni di coltura utilizzati sono 3:

terreni a base di tuorlo d'uovo (come sorgente di lipidi)

terreni a composizione chimica definita solidificati con agar

terreni a composizione chimica definita liquidi: ex un terreno liquido selettivo con l'aggiunta di palmitato marcato con carbonio radioattivo, che viene metabolizzato dai micobatteri con liberazione di CO₂ radioattiva, è utilizzato x l'isolamento dei micobatteri da materiali patologici

MICOBATTERI DI INTERESSE MEDICO

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS → agente eziologico della tubercolosi umana

MYCOBACTERIUM AFRICANUM → in Africa, patologia, sovrapponibile a M. tuberculosis

MYCOBACTERIUM BOVIS → agente eziologico della tubercolosi bovina, trasmissibile all'uomo (zoonosi) x via alimentare (carni o latte non pastorizzato, proveniente da animali infetti).

MICOBATTERI NON TUBERCOLATI (MOOT) → in genere sono contaminanti ambientali o parassiti di varie specie animali, che sono occasionalmente in grado di infettare la specie umana, cmq richiedono la concomitanza di condizioni ( immunodepressione, denutrizione, presenza di traumi)favorenti. Micobatteri opportunisti.

MYCOBACTERIUM  LEPRAE → agente eziologico della lebbra.

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

È l'agente eziologico della tubercolosi

Caratteri antigeni → 2 classi di antigeni :

natura polisaccaridica

natura proteica

I lipidi degli involucri esterni hanno una potente azione coadiuvante l'immunogenicità delle

porzioni antigeniche polisaccaridiche e proteiche, favorendo il reclutamento delle cellule

immunocompetenti.

MECCANISMO D'AZIONE PATOGENA

non produce esotossine proteiche (anche se si è osservata la produzione di emilisine e lipasi)

la capacità del batterio di resistere al killing intracellulare nelle cellule fagocitarie è l'elemento centrale del meccanismo della sua azione patogena; questo può avvenire attraverso l'inibizione della fusione fagosoma-lisosoma sia attraverso la liberazione della acidificazione del contenuto del fagolisosoma. Un ruolo importante nella tossicità è dato dal "fattore cordale".

L'infezione si contrae x via aerogena.

Nel soggetto resistente, il processo infiammatorio rimane localizzato, coinvolgendo alcuni linfonodi mediastinici satelliti complesso primario :

Una volta depositati negli spazi alveolari dei polmoni, si innesca un processo infiammatorio di tipo "essudativo", con una prevalente componente vascolare, seguito da intenso accumulo di cellule fagocitarie di tipo macrofagico. I bacilli vengono fagocitati dai macrofagi alveolari e in gran parte uccisi con la presentazione di diversi materiali antigeni micobatterici ai linfociti Th e il conseguente innesco della risposta immune. Alcuni batteri xò, riescono a sopravvivere e a moltiplicarsi all'interno dei macrofagi, uccidendoli e liberandosi nell'ambiente extracellulare e danneggiando i tessuti circostanti. La comparsa di macrofagi attivati, e di linfociti CD8 citotossici riesce a contenere l'infezione, con l'attivazione di un processo infiammatorio di tipo granulomatoso con un denso infiltrato di cellule mononucleate che circonda un insieme di cellule. La lesione è denominata tubercolo e viene circondata da un'intensa reazione connettivale (fibrosi) ad opera di fibroblasti e la porzione centrale, va in contro a necrosi caseosa, che diviene la sede successiva di precipitazione di sali di calcio.

In una % di soggetti la lesione granulomatosa iniziale, si traduce in una infezione cronica paucibacillare, asintomatica, ma con la persistenza di micobatteri, che possono rimanere vitali x lunghissimi periodi (decenni). Ciò necessita una sorveglianza immunologica continua ed il persistere dei macrofagi "attivati" e di linfociti CD4 e CD8 di memoria.

Occasionalmente, una diminuita efficacia del sistema immune (infezione da HIV) possono portare alla riattivazione del complesso primario, con la ripresa della moltiplicazione dei batteri e la formazione di lesioni granulomatose multiple che confluiscono, in seguito alla necrosi e alla colliquazione della porzione centrale; possono svuotare il loro contenuto in circolo con la diffusione metastatica dell'infezione in altre sedi polmonari i extrapomonari (tubercolosi miliare, tubercolosi meningea, renale, ossea).

DIAGNOSI DI INFEZIONE

- La diagnosi di infezione tubercolare è possibile solo mediante la ricerca di M. tubercolosis in un idoneo materiale patologico.

RICERCA MICROSCOPICA → Il reperto di bacilli acido-resistenti in un preparato microscopico opportunamente colorato e osservato al MO, rappresenta una 1° evidenza della presenza di M. tuberculosis. Il materiale patologico è rappresentato da espettorato ( xchè la tubercolosi è un'affezione primitivamente a sede polmonare). Inoltre se viene in contatto con la popolazione batterica residente del cavo orale e delle vie aeree, in questi tipi di batteri non esistono bacilli acido resistenti (M. tubercolosis).

ESAME COLTURALE → inoculando il materiale patologico, adeguatamente emulsionato, sulla superficie di provette contenenti uno dei vari terreni solidi al tuorlo d'uovo e verde di malachite. A causa del lento sviluppo il materiale da esaminare deve essere preventivamente decontaminato dalla popolazione microbica accessoria, x evitare la crescita delle altre specie microbiche che possono esaurire la disponibilità di nutrienti. Ciò si ottiene sfruttando la capacità dei micobatteri di sopravvivere alla esposizione a basi forti  (l'espettorato viene mescolato con N-acetil-cisteina ed il 2-3% di NaOH a temperatura ambiente x 10 min) in modo da uccidere gran parte degli altri microrganismi presenti. Il verde di malachite è ben tollerato dai micobatteri ed è in grado di impedire lo sviluppo di microrganismi (miceti).

IDENTIFICAZIONE → Nelle colture incubate a 37°C, lo sviluppo di M. tuberculosis comincia ad essere apprezzabile dopo 2-3 settimane. Le colonie sono facilmente riconoscibili, x l'aspetto rigoglioso (eugonico) con leggera pigmentazione giallastra. L'identificazione definitiva può avvalersi di rilevazioni di alcuni parametri biochimici o biologici; oppure mediante sonde molecolari specifiche x sequenze di DNA esclusive x M. tuberculosis, infatti la ricerca di sequenze specifiche di DNA di M. tuberculosis, mediante tecniche di amplificazione genomica (P.C.R.) seguita dalla ibridazione con idonee sonde molecolari, è possibile fare diagnosi di infezione in 1-2gg.

RICERCA DI M. TUBERCULOSIS MEDIANTE PROVA BIOLOGICA → X l'isolamento dei micobatteri da materiali patologici, si può ricorrere alla inoculazione del materiale in esame nel sottocutaneo di una cavia che viene a morte dopo 25-40 gg, con un quadro di tubercolosi generalizzato.

INDAGINI SIEROLOGICHE → INTRADERMOREAZIONE CON "TUBERCOLINA"                              Di notevole utilità ai fini epidemiologici è l'accertamento della presenza di immunità cellulo-mediata specifica x M. tuberculosis, mediante l'inoculazione intradermica di "tubercolina" (reazione di Mantoux). La tubercolina o (PPD) è formata da proteine micobatteriche purificate mediante successive precipitazioni con solfato d'ammonio. La reazione viene praticata mediante reazione intradermica di 0,1 ml di una adeguata concentrazione di PPD nella faccia volare dell'avambraccio. Il trattamento non provoca alcuna reazione nei soggetti indenni da infezione tubercolare. Mentre nei soggetti che abbiano subito un'infezione si osserva localmente dopo 24-48h (allergia ritardata), una reazione infiammatoria che si appalesa con la comparsa di una papula eritematosa. Poiché l'allergia ritardata, nell'infezione tubercolare, una volta instauratasi si mantiene x tutta la vita, anche quando le lesioni siano guarite, la positività della reazione, non sta ad indicare un'infezione attiva ma soltanto un precedente contatto con M. tuberculosis.

TERAPIA

- Alcuni antibiotici: streptomicina, rifampicina, e chemioterapici come : isoniazide, etambutolo, sono efficaci contro M. tuberculosis.

- Poiché presenta facilmente la comparsa di varianti farmaco-resistenti, è consigliabile saggiare in vitro la efficacia nei confronti dello stipite micobatterico (antibiogramma).

- Si ricorre molto spesso alla multi-terapia: isoniazide + rifampicina + pirazinamide + etambutolo, che devono essere somministrati x almeno 2 mesi, alla quale deve poi seguire una terapia di mantenimento con isoniazide e rifampicina 3 volte alla settimana x 4 mesi.

IMMUNIZZAZIONE

- il vaccino antitubercolare, oggi disponibile, è costituito da una variante apatogena di Mycobacterium bovis, scoperto da Calmette e Guerin, è denominata B.C.G. (bacillo di Calmette e Guerin). L'inoculazione di B.C.G. x via intracutanea, si accompagna a modesti segni di reazione locale, ed è seguita dall'instaurarsi di immunità cellulo mediata specifica (dimostrabile con la positività alla intradermoreazione di Mantoux). Nei paesi industrializzati la vaccinazione non viene praticata.

MICOBATTERI NON TUBERCOLARI

Si tratta di contaminati ambientali o di parassiti di varie specie animali, occasionalmente in grado di infettare l'uomo (immunocompromesso) e con la coinfeizione (batteri opportunisti).

4 gruppi principali che si basano a seconda del ritmo di crescita nelle colture:

fotocromogeni a crescita lenta: simili nei tempi a quella di M.tuberculosis e producono un'intensa pigmentazione (giallastra) nelle colture, che si produce solo dopo esposizione a una forte sorgente luminosa

scotocromogeni a crescita lenta

non cromogeni a crescita lenta: non producono pigmento

non cromogeni a crescita rapida: non producono colonie pigmentate, con uno sviluppo completo nelle colture in meno di 7gg.

DIAGNOSI DI INFEZIONE

E' basata sull'isolamento colturale dal materiale patologico in esame.

Alcuni micobatteri non tubercolari presentano esigenze nutrizionali o crescono con estrema lentezza o possono non essere repertate nelle colture allestite x M. tuberculosis. Quindi è necessario l'impiego di terreni arricchiti e incubazione della coltura x tempi molto lunghi.

L'identificazione : si basa sull'analisi del profilo biochimico o con > rapidità sull'impiego di sonde molecolari specifiche x il genoma delle singole specie micobatteriche. L'impiego di sonde molecolari deve essere accompagnata all'impiego di tecniche di amplificazione (P.C.R.) delle sequenze genomiche bersaglio.

TERAPIA

- La sensibilità ai farmaci antimicobatterici può cambiare da una specie all'altra, xciò è necessario uno studio preliminare dello spettro dei farmaci attivi in vitro nei confronti dei singoli stipiti isolati.

MYCOBACTERIUM LEPRAE

BACILLO

È un bacillo acido-resistente, non è possibile coltivare in vitro.

EZIOLOGIA

Agente eziologico della lebbra. La lebbra è una malattia cronica a lungo decorso con un lunghissimo periodo di incubazione (alcuni anni), clinicamente caratterizzata dalla presenza di lesioni granulomatose (istologicamente simili a quelle tubercolari) cutanee e mucose (noduli leprosi) che vanno incontro ad ulcerazione (ma non a caseificazione) provocando spesso mutilazioni deformanti (volto) e da lesioni che coinvolgono varie terminazioni nervose periferiche con comparsa di vaste aree di anestesia cutanea.

La malattia si trasmette x contagio interumano.

MECCANISMO D'AZIONE PATOGENA

L'infezione umana è localizzata nel citoplasma dei macrofagi, in cui sembra potersi replicare e dove si dispone in ammassi di batteri paralleli "a mazzo di sigari".

DIAGNOSI

È in genere clinica ed è confermata dal reperto microscopico di bacilli acido-resistenti nel citoplasma dei macrofagi (cellule leprose) presenti nel materiale proveniente dai granulomi cutanei o mucosi.

TERAPIA

Utilizzo della terapia multipla: clofazimina + dapspone + rifampicina + clofazimina. Si ottiene l'eradicazione dell'infezione in 15-20 mesi.