OSSIDASI

L'ossidasi è un enzima che catalizza l'ossidazione del citocromo ridotto.

Essa viene messa in evidenza utilizzando un composto che nello stato ridotto è incolore, ma che assume una colorazione particolare allo stato ossidato.

Il test viene utilizzato per distinguere gli enterobatteri da pseudomonas

La prova si esegue su colonie batteriche. E' opportune che le colonie non si presentino troppo colorate, come può accadere utilizzando taluni terreni selettivi, per evitare la difficoltà di interpretare l'eventuale positività.

E' necessario inoltre evitare il prelievo delle colonie con ansa di Ni-Cr che può interferire con l'esito della prova.

Reattivo: da preparare al momento dell'uso data la sua rapida ossidazione

reattivo di Kovacs (sol. acquosa 1% di N,N,N,N terta-metil-p-fenilendiammina); il reattivo pronto per l'uso deve essere incolore

Esistono anche reattivi diversi per l'esecuzione della prova reperibili sul mercato anche sotto forma di dischetti, tamponi, striscette..

Materiale:

una striscia di carta da filtro

un bastoncino di legno o ansa di platino

una piastra petri, anche non sterile

Procedimento

mettere la striscia di carta da filtro nella piastra vuota

porre 1 - 2 gocce di reattivo sulla striscia

prelevare una colonia o una porzione di colonia con il bastoncino di legno

stemperare, in una zona ristretta, la colonia prelevata. Attendere 30 - 60 secondi

Lettura:

positività della prova: la comparsa di una colorazione viola intenso entro 30'' - 60''

negatività della prova la mancata comparsa della colorazione entro 30'' - 60''

Colorazioni che compaiono dopo 60 secondi non hanno significato di positività.

N.B. la prova può essere eseguita direttamente sulle colonie mettendo su di esse 2-3 gocce di reattivo. La lettura è quella vista sopra, ma deve avvenire entro 10 - 20 minuti.

Norme di sicurezza

STUDIO DEL TIPO DI METABOLISMO BATTERICO

TEST O/F (ossido-fermentazione)

La prova ha lo scopo di evidenziare la modalità con cui un microrganismo può demolire (metabolizzare) uno zucchero.

Il test è di solito utilizzato per verificare il tipo di metabolismo nei confronti del glucosio

(altri zuccheri utilizzati sono lattosio e maltosio)

il terreno contiene una bassa quantità di peptoni per evitare che una loro degradazione, con metabolismo ossidativi, porti alla formazione di prodotti alcalini che maschererebbero l'acidità derivante dal carboidrato. L'agar -agar presente nel terreno impedisce ai prodotti acidi formatisi di disperdersi verso la superficie con conseguente loro diluizione. Ciò renderebbe difficile l'interpretazione del test.

Procedimento:

la prova si esegue a partire da colonie batteriche e non da colture liquide.

Il terreno utilizzato per la prova deve essere sterile.

Terreno: Hugh - Leifson medium (test O/F medium)

Composizione                        g/l

Digerito pancreatico di caseina                               2

Sodio cloruro                         5

K₂HPO₄                                  0,3

Agar-agar                               2,5

Blu di bromotimolo               0,03

pH finale 7,1+0,1

Preparazione del terreno:

il terreno base viene preparato secondo le indicazioni riportate sulla confezione.

Lo zucchero da saggiare può essere addizionato al terreno:

Durante la preparazione, pesando la quantità necessaria e sciogliendola nel terreno

In questo caso è necessario utilizzare una temperatura di sterilizzazione di 115-118°C

Per 10 -15 min.

Dopo la sterilizzazione del terreno addizionando una soluzione dello zucchero sterilizzato per filtrazione, la concentrazione finale dello zucchero nel terreno pronto per l'uso deve essere dell1%. Ciò si realizza preparando e sterilizzando una soluzione al 10% del carboidrato e addizionandone 10 ml per ogni 100 ml di base.

STUDIO DEL TIPO DI METABOLISMO BATTERICO    TEST O/F (ossido-fermentazione)

Inoculo del terreno:

devono essere inoculate, per ogni test , 2 provette di terreno.

Prelevare con un ago una porzione di colonia o una colonia intera.

Eseguire una infissione per 2/3 del terreno, il terreno è semisolido e tale tipo di semina va quindi fatta con attenzione: sterilizzando tutto l'ago che viene infisso nel terreno,

raffreddandolo bene per non liquefare il terreno durante l'inoculo.

In una dei due terreni inoculati stratificare alcuni ml di olio minerale (olio di vaselina o paraffina) in modo da ottenere uno strato di 2-3 cm sopra la superficie del terreno.

Temperatura e tempo di incubazione:

37°C o la temperatura ottimale del microrganismo in esame

fino a 7 giorni dopo l'inoculo

Lettura: verificare la presenza di sviluppo e l'eventuale viraggio del terreno al giallo o al blu in entrambi i terreni. La lettura viene eseguita ogni 24 ore per 7 giorni

Interpretazione del risultato:

Norme di sicurezza

DETERMINAZIONE DELLA CAPACITA' DI FERMENTAZIONE DEI CARBOIDRATI

Per determinare la capacità fermentativa di un microrganismo si utilizza un terreno nutritivo che contiene: un indicatore di ph, lo zucchero o il polialcool da saggiare e una campanella di Durham se è necessario evidenziare anche la produzione di gas.

Terreno utilizzato: brodo per fermentazione al rosso fenolo

Composizione g/l:

peptone di carne                    g 10

estratto di carne                     g 3

cloruro di sodio                     g 5

rosso fenolo                           g 0,018

zucchero o polialcool           g 10

pH finale 7,4 ⁺ 0,1

Preparazione

il terreno base viene preparato secondo le indicazioni riportate sulla confezione.

Lo zucchero o il polialcool da saggiare viene aggiunto al terreno base con una delle seguenti modalità:

durante la preparazione del terreno base, pesando l'opportuna quantità del composto

dopo la sterilizzazione del terreno, addizionando una opportuna quantità di soluzione dello zucchero, sterilizzata per filtrazione ( es: 10 ml soluzione al 10% di zucchero per 100 ml di terreno base)

dopo la sterilizzazione del terreno, addizionando un dischetto di zucchero

N.B. La concentrazione del carboidrato nel terreno pronto per l'uso è dell'1%, salvo

casi particolari.

Se è necessario evidenziare la produzione di gas inserire nel terreno una campanella di Durham prima della sterilizzazione.

DETERMINAZIONE DELLA CAPACITA' DI FERMENTAZIONE DEI CARBOIDRATI

Tecnica di semina

è possibile utilizzare una delle seguenti tecniche:

un'ansata di agar-coltura, avendo cura in questo caso di emulsionare con cura l'inoculo

una goccia di coltura del microrganismo in esame

N.B. inoculare anche una provetta di solo terreno base come controllo negativo

Temperatura e tempo di incubazione:

37°C o alla temperatura ottimale del microrganismo,

per 24- 48 ore o più a seconda dei casi

Lettura:

Controllo negativo

sviluppo del microrganismo senza variazioni di colore del terreno

Prova positiva :

si ha fermentazione del carboidrato o del polialcool quando si osserva il viraggio al giallo dell'indicatore presente nel terreno di coltura

Produzione di gas

lo svuotamento totale o parziale della campanella di Durham indica la produzione di gas conseguente all fermentazione

Prova negativa

il carboidrato o il polialcool non sono fermentati se il terreno, pur evidenziando uno sviluppo, non cambia la sua colorazione iniziale (arancione-rossa)

il carboidrato o il polialcool non sono fermentati se il terreno, pur evidenziando uno sviluppo, vira al rosso (confrontare con il controllo negativo)

Una colorazione arancione va interpretata caso per caso.

Norme di sicurezza

STUDIO DELLA MOBILITA' BATTERICA

La mobilità dei batteri è un carattere che viene utilizzato nell'identificazione di alcune specie batteriche. Alcuni ceppi batterici possono risultare poco mobili al primo isolamento e sono necessari alcuni accorgimenti tecnici per metterla in evidenza.

Nello studio della mobilità riveste grande importanza la temperatura di incubazione delle colture, infatti non sempre la temperatura ottimale di incubazione è la temperatura più adatta per evidenziare la mobilità ad es: un microorganismo può essere mobile a 20°C, ma risultare immobile se incubato a 37°C.

Lo studio della mobilità di una specie batterica si può effettuare:

tramite osservazione diretta al microscopio utilizando la tecnica della goccia pendente

tramite l'utilizzo di terreni semisolidi

Studio della mobilita' in terreno semisolido

Terreno utilizzato

terreno per test della mobilità o agar molle

Composizione            g/l

Triptone 10

Cloruro di sodio 5

Agar-agar                   5

pH finale 7,4  Sterilizzare a 121°C per 15 minuti

Preparazione del terreno:

sciogliere i componenti del terreno in un adatto volume di acqua distillata, distribuire il terreno, in ragione di 8-10 ml per provetta. Dopo la sterilizzazione far solidificare il terreno in posizione verticale.

Tecnica di semina

per infissione. Data la consistenza semisolida del terreno prestare attenzione all'infissione che deve formare un unico canale, il più possibile verticale, per 2/3 del terreno (non eseguire una infissione che tocchi il fondo della provetta).

Temperatura e tempo di incubazione:

alla temperatura più adatta ad evidenziare la mobilità; di solito si utilizzano i 20°C

per 24-48 ore o più se necessario.

STUDIO DELLA MOBILITA' BATTERICA

Lettura:

Prova positiva: microrganismo mobile

il microrganismo in esame risulta mobile se si è sviluppato oltre il canale di infissione, sia verso il basso che lateralmente.

Prova negativa: microrganismo immobile

Il microrganismo in esame risulta invece immobile se si è sviluppato unicamente lungo il canale di infissione.

Norme di sicurezza

FLUIDIFICAZIONE DELLA GELATINA (produzione di gelatinasi)

La gelatina è una miscela di proteine ottenuta per idrolisi del collagene (costituente fondamentale del tessuto connettivo). Industrialmente viene estratta dalle ossa di animali e dalla vescica natatoria di alcuni pesci (colla di pesce)

La gelatina gelifica al di sotto di 25°C ; a temperature superiori è liquida.

La demolizione della gelatina avviene per l'azione proteolitica dell'enzima gelatinasi che la degrada nei suoi amminoacidi costituenti, causandone la fluidificazione.

Terreno utilizzato

gelatina nutritiva o brodo nutritivo addizionato del 10-15% di gelatina

Composizione:

gelatina 120 g

peptone    8 g

ph finale 7⁺ 0,2

Preparazione del terreno:

secondo le indicazioni sulla confezione. Mescolare bene la polvere pesata con l'acqua durante il riscaldamento, che deve avvenire lentamente (se possibile a bagnomaria o a vapore fluente). Distribuire in provetta 10 ml di terreno e solidificare in posizione verticale.

Tecnica di semina:

per infissione (inoculare con ago 2/3 del terreno)

Temperatura e tempo di incubazione:

metodo lento: a 20-22°C fino a 30 giorni dall'inoculo

metodo rapido: a 32-37°C per 48-72 ore

FLUIDIFICAZIONE DELLA GELATINA (produzione di gelatinasi)

Lettura:

metodo lento: osservare periodicamente la coltura per constatare la fluidificazione della gelatina. E' possibile osservare anche le forme assunte dalla parte fluidificata della gelatina che sono caratteristiche per alcuni tipi di microrganismi e possono essere quindi utilizzate per l'identificazione.

metodo rapido: prima di osservare il terreno è necessario raffreddarlo in un bagno di ghiaccio o in frigorifero (per 30 min). Questo metodo non consente di osservare le forme della parte fluidificata della gelatina, ma solamente la fluidificazione.

Norme di sicurezza

DEGRADAZIONE DEGLI AMMINOACIDI

La prova permette di evidenziare l'utilizzazione di un amminoacido da parte di un microrganismo. L 'avvenuta utilizzazione può essere messa in evidenza:

evidenziando la scomparsa dell'amminoacido (procedura piuttosto complessa)

evidenziando la formazione di prodotti del metabolismo dell'amminoacido (es: ammine e anidride carbonica)

I metodi utilizzati in laboratorio sfruttano, al fine di evidenziare l'utilizzazione dell'amminoacido, l'accumulo di ammine e il conseguente innalzamento del pH del terreno che viene messo in evidenza dal viraggio di un indicatore.

I metodi di laboratorio più comuni consentono di evidenziare l'utilizzazione solo di tre amminoacidi:

arginina

lisina

ornitina

Per gli altri amminoacidi le procedure risultano molto complesse e difficilmente utilizzabili nella routine. I terreni utilizzati per l'esecuzione della prova possono variare nella composizione a seconda della specie batterica in esame.

Terreno utilizzato:

brodo per decarbossilazione di Moeller

Composizione in g/l

Peptone                                  5 g

Estratto di carne                    5 g

Glucosio                                 0,5 g

Piridossale                             0,005 g

Bromocresolo porpora           0,02 g

pH finale 6,0 ⁺ 0,1

Preparazione:

Seguire le istruzioni presenti sulla confezione del terreno. Al terreno base va addizionato l'amminoacido da saggiare in concentrazione pari all'1% (p/v) se si dispone dell'amminoacido in forma L : L-arginina, L-lisina, L-ornitina.

Se si dispone di amminoacidi in forma DL la concentrazione nel terreno deve essere del 2% (p/v). Il terreno viene distribuito in provetta (4-5 ml)

NOTA BENE :

Controllare con cura il pH del terreno prima della distribuzione.

Preparare sempre una provetta di terreno base senza amminoacidi come controllo.

Il terreno pronto per l'uso ha una colorazione porpora.

DEGRADAZIONE DEGLI AMMINOACIDI

Tecnica di semina:

per dispersione con ansa, evitando inoculi pesanti (troppo abbondanti)

Inoculare anche un terreno senza amminoacido come controllo negativo.

Dopo l'inoculo versare sulla superficie del terreno uno strato di olio di vaselina (o paraffina liquida). Tale operazione va eseguita facendo scorrere lentamente lungo le pareti della provetta la paraffina in modo da stratificarla sulla superficie liquida.

Temperatura e tempo di incubazione:

37°C per 4 giorni.

Lettura:

controllare giornalmente le variazioni di colore del terreno con amminoacido e del terreno di controllo (senza amminoacido).

La fermentazione del glucosio e il conseguente abbassamento del pH del terreno favorisce le reazioni di decarbossilazione. Tali reazioni producono ammine che rendono alcalino il terreno con conseguente viraggio dell'indicatore da giallo a porpora.

Norme di sicurezza

UTILIZZAZIONE DEI NITRATI

I microrganismi sono in grado, a seconda del loro corredo enzimatico, di utilizzare

i nitrati e ridurli a composti quali:

nitriti

ammoniaca

ossido di azoto

azoto gassoso

La prova viene eseguita in un terreno che contiene nitrato; i prodotti di riduzione vengono messi in evidenza con l'uso di reattivi specifici o accorgimenti particolari.

Terreno utilizzato:

Brodo nitrati

Composizione g/l

triptone                       10 g

cloruro di sodio          5 g

Nitrato di potassio     1 g

pH finale 7,2

Preparazione :

seguire le indicazioni sulla confezione. Il terreno viene distribuito in provetta (5 - 7 ml) nella quale viene posta anche una campanella di Durham.

Sterilizzazione a 121°C per 15 min.

Tecnica di semina:

un'ansata di agar-coltura o di brodocoltura.

Temperatura e tempo di incubazione:

37°C (o eventuale altra temperatura ottimale) fino a 7 giorni.

UTILIZZAZIONE DEI NITRATI

Lettura:

controllare la crescita del microrganismo osservando la torbidità della brodocoltura prima di eseguire le prove indicate.

Norme di sicurezza

STUDIO DEL METABOLISMO DEL GLUCOSIO:

PROVA DEL ROSSO METILE E PROVA DI VOGES PROSKAUER

La prova del rosso metile (RM) e la prova di Voges Proskauer (VP) sono importanti per l'identificazione degli enterobatteri..

Gli enterobatteri utilizzano il glucosio attraverso due particolari vie fermentantative,

che partendo dall'acido piruvico originano prodotti finali diversi:

v    la fermentazione butandiolica (o glicol-butilenica) ha come prodotti finali principali: etanolo, 2,3 butandiolo, acido formico (che in presenza di formico-idrogenoliasi viene scisso in idrogeno e anidride carbonica)

v    la fermentazone acido mista ha come principali prodotti finali:

etanolo, acido acetico, acido lattico, acido formico (che in presenza di formico-

idrogenoliasi viene scisso in idrogeno e anidride carbonica)

Terreno utilizzato:

brodo MRVP

Composizione g/l

peptone            5 g

D(+) glucosio                         5 g

di-potassio idrogeno fosfato 2,5 g

potassio di-idrogeno fosfato 2,5 g

ph finale 7,5

Preparazione:

secondo le istruzioni presenti sulla confezione.

Il terreno viene distribuito in provette (5 ml) e sterilizzato.

Tecnica di semina:

una o due colonie da disperdere omogeneamente nel terreno

un o due gocce di brodocoltura

Temperatura e tempo di incubazione:

32 - 37°C

per 3 - 4 giorni

PROVA DEL ROSSO METILE E PROVA DI VOGES PROSKAUER

Lettura:

controllare la crescita del microrganismo osservando la torbidità del terreno ed eseguire poi la prova di Voges Proskauer e quella del rosso metile.

Prova di Voges-Proskauer (ricerca dell'acetoina o acetilmetilcarbinolo):

la prova mette in evidenza la produzione di acetilmetilcarbinolo derivante dalla fermentazione glicol-butilenica del glucosio. Il ph del terreno in questo caso si avvicina alla neutralità. L'acetilmetilcarbinolo o acetoina può ossidarsi ad opera di una deidrogenasi NAD dipendente, ma può ossidarsi anche spontaneamente a diacetile. E' proprio il diacetile che dà la reazione di Voges Proskauer.

Norme di sicurezza

PROVA DEL ROSSO METILE E PROVA DI VOGES PROSKAUER

Prova del rosso metile:

mette in evidenza l'elevata acidità del terreno di coltura (ph < 4,5) dovuta all'accumulo di prodotti della fermentazione acido-mista del glucosio.

Norme di sicurezza

UTILIZZAZIONE DEL CITRATO COME UNICA FONTE DI CARBONIO

La prova evidenzia la capacità del microrganismo di utilizzare il citrato come unica fonte di carbonio. Il terreno di coltura non contiene peptoni, ma contiene:

CITRATO DI SODIO come fonte di carbonio

AMMONIO FOSFATO come fonte di azoto

Sul terreno pertanto possono svilupparsi solamente i microrganismi in grado di utilizzare tali sostanze.

Terreno utilizzato:

agar citrato di Simmons

Composizione g/l

NaCl     5 g

MgSO₄ x 7H₂O                      0,2g

(NH)₄H₂PO₄               1 g

K₂HPO₄                                  1 g

Citrato di sodio                      5 g

Blu bromotimolo 0,08 g

Agar-agar                   20 g

pH finale 7

sterilizzare a 121°C per 15 minuti

il terreno viene distribuito in provetta e solidificato a becco di clarino.

Inoculo:

con un'ansata di patina batterica sulla parte inclinata del terreno, facendo attenzione a non trasportare tracce del terreno colturale sul quale si è sviluppata la coltura (per non fornire altre fonti di carbonio diverse dal citrato)

Temperatura e tempo di incubazione:

37°C o alla temperatura ottimale del microrganismo per 24-48 ore

UTILIZZAZIONE DEL CITRATO COME UNICA FONTE DI CARBONIO

Lettura:

l'avvenuta utilizzazione del citrato si evidenzia con lo sviluppo batterico ed il viraggio dell'indicatore al blu

la mancata utilizzazione del citrato si evidenzia con il mancato sviluppo batterico ed il conseguente mancato viraggio del terreno che rimane verde (colore del terreno prima della semina)

Utilizzazione dei citrati in terreno liquido

L'utilizzazione del citrato può essere messa in evidenza nel brodo di Koser che nella sua composizione differisce da quello di Simmons per la mancanza dell'indicatore e dell'agente solidificante (agar-agar)

La lettura avviene semplicemente osservando l'eventuale sviluppo del microrganismo che indica l'utilizzazione del citrato.

Norme di sicurezza

UTILIZZAZIONE DELLA FENILALANINA

E PRODUZIONE DI ACIDO FENILPIRUVICO (APP)

L'amminoacido fenilalanina può essere deaminato ossidativamente ad acido fenilpiruvico mediante l'enzima fenilalanina-deaminasi.

L'acido fenilpiruvico prodotto viene messo in evidenza facilmente con una soluzione di cloruro ferrico.

La prova è particolarmente imporante per l'identificazione del genere Proteus.

Terreno utilizzato:

agar fenilalanina

Composizione g/l

estratto di lievito       3 g

peptone 10 g

NaCl                           5 g

K₂HPO₄                      1 g

L- fenilalanina 1 g

Agar-agar             20 g

pH finale 7,2

sterilizzare a 121°C per 15 min.

il terreno viene distribuito in provetta e solidificato a becco di clarino.

Inoculo del terreno:

un'ansata di un'agar-coltura o di brodocoltura del microrganismo in esame

Temperatura e tempo di incubazione:

37°C per 24-48 ore

UTILIZZAZIONE DELLA FENILALANINA E PRODUZIONE DI ACIDO FENILPIRUVICO (APP)

Lettura:

dopo aver verificato l'avvenuto sviluppo del microrganismo, versare sulla superficie del becco di clarino alcune gocce (5 - 6) di una soluzione di cloruro ferrico al 10%

Prova positiva: la comparsa di una colorazione verde della superficie del terreno indica presenza di acido fenilpiruvico (APP) e quindi l'avvenuta deaminazione della fenilalanina.

Prova negativa: la mancata comparsa di colorazione indica la mancata utilizzazione della fenilalanina.

N.B. la soluzione di cloruro ferrico ha una colorazione gialla.

Norme di sicurezza

PRODUZIONE DI INDOLO (prodotto del metabolismo del triptofano)

I microrganismi che degradano l'amminoacido triptofano producono indolo, un composto volatile che viene messo in evidenza mediante uno specifico reattivo.

La presenza dell'indolo indica l'avvenuta utilizzazione del triptofano.

Terreno utilizzato:

acqua peptonata o acqua triptonata

il peptone presente nel terreno deve contenere una certa quantità dell'amminoacido triptofano.

Composizione g/l

Triptone 10 g

NaCl   5g

pH finale 7,2

Il terreno viene distribuito in provetta (5 ml)

Sterilizzare a 121°C per 15 minuti

Tecnica di semina:

un'ansata di agarcoltura o di brodocoltura per dispersione nel terreno

Temperatura e tempo di incubazione:

37°C o alla temperatura ottimale del microrganismo per 24-48 ore

Lettura:

dopo aver verificato lo sviluppo del microrganismo, addizionare alla brodocoltura

0,5 ml (10 gtt.circa) di reattivo di Kovacs (che viene conservato a +4°C)

ed agitare con cura.

Prova positiva: la comparsa immediata di un anello rosso sulla superficie del terreno indica la presenza di indolo.

Prova negativa: la mancata comparsa dell'anello rosso e l'osservazione di un anello giallo pallido indica invece l'assenza di indolo.

Norme di sicurezza

UTILIZZAZIONE DELL'ACIDO DESOSSIRIBONUCLEICO (DNA)

PROVA DELLA Dnasi

L'enzima extracellulare desossiribonucleasi (Dnasi) è in grado di scindere il DNA, in particolare è in grado di idrolizzare i legami 5'-fosfodiesterici della molecola.

Terreni utilizzati:

Dnasi test agar

Composizione g/l

Peptone 20 g

DNA       2 g

NaCl        5 g

pH finale 7,3

Sterilizzare a 121°C per 15 min

Il terreno viene distribuito in piastra (diam: 60mm o da 90 mm)

Dnasi test agar con verde metile (Dnase test agar with methyl green)

Composizione g/l

Triptosio    20 g

DNA               2 g

NaCl               5 g

Verde metile 0,05 g

pH finale 7,3

Sterilizzare a 121°C per 15 minuti

Il terreno viene distribuito in piastra (diam: 60mm o da 90 mm)

Tecnica di semina:

inoculare pesantemente con ansa, concentrando l'inoculo al centro della piastra

Temperatura e tempo di incubazione:

37°C o alla temperatura ottimale del microrganismo per 24 - 48 ore

PROVA DELLA Dnasi

Lettura:

Dnase test agar

Versare sulla superficie della piastra 1-2 ml di HCl 1N ed attendere qualche minuto.

Osservare la piastra contro fondo scuro.

Prova positiva: la comparsa di un alone trasparente intorno alla patina batterica, mentre il terreno circostante risulta opaco. Ciò è dovuto alla scomparsa dell'acido desossiribonucleico (alone trasparente) ed alla precipitazione dell'acido desossiribonucleico non idrolizzato (terreno circostante opaco)

Prova negativa: la mancata presenza dell'alone trasparente. Tutto il terreno risulta pertanto opaco.

Dnase test agar con verde metile: la lettura del risultato viene fatta direttamente osservando il terreno di coltura.

Prova positiva: la comparsa di un alone trasparente intorno alla patina batterica, mentre il terreno circostante risulta verde. Ciò è dovuto alla scomparsa dell'acido desossiribonucleico polimerizzato (alone trasparente il verde metile non più legato al DNA schiarisce) ed alla presenza dell'acido desossiribonucleico polimerizzato e quindi ancora legato al verde metile (terreno circostante verde)

Prova negativa: la mancata presenza dell'alone trasparente. Tutto il terreno risulta pertanto verde.

Norme di sicurezza

RICERCA DELLA TERMONUCLEASI

(Dnasi termoresistente)

L'enzima termonucleasi o DN-asi termoresistente viene prodotta e liberata dalla maggior parte dei ceppi di Staphylococcus aureus.

L'enzima idrolizza l'acido desossiribonucleico ed è caratterizzato da una elevata termoresistenza, cioè è in grado di esplicare la sua azione anche dopo essere stato sottoposto ad un riscaldamento a 100°C per 15 minuti. Altri esoenzimi con azione simile alla termonucleasi vengono inattivati dal trattamento citato.

La prova viene eseguita su un terreno nel quale il colorante blu di o-toluidina si lega all'agar-agar ed al DNA formando aggregati molecolari ed assumendo una colorazione blu scuro.

Quando il blu di toluidina invece si trova legato solamente all'agar-agar assume una colorazione rosa.

Materiale e reattivi:

terreno pronto per l'uso che si presenta di colore blu scuro

dischetti di carta diam. 6 mm sterili (dischi bianchi)

dischetti impregnati di termonucleasi diam. 6 mm sterili (dischi controllo positivo)

una pinzetta

una brodocoltura fresca, di 6 - 18 ore piuttosto torbida, in BHI del microrganismo

Procedimento:

trattare la brodocoltura del ceppo in esame a 100°C per 15 minuti in bagnomaria

preparare sul banco di lavoro la piastra di terreno, i dischi bianchi, i dischi di controllo positivo

con la pinzetta, precedentemente posta in un becker con alcool, prelevare un dischetto bianco ed immergerlo alcuni secondi nella brodocoltura trattata

eliminare l'eccesso di liquido, premendo contro le pareti della provetta,

porre il dischetto sulla superficie del terreno, premere delicatamente per farlo aderire

prelevare un dischetto di controllo positivo e porlo sulla superficie del terreno

come controllo negativo è possibile immergere un dischetto bianco nel brodo di coltura sterile e porlo anch'esso sulla superficie della piastra

N.B. i dischetti vanno distanziati tra loro e dal bordo della piastra di circa 20 - 25 mm

Siglare sul fondo della piastra i vari dischetti con lettere o numeri ad es: C+ o P per controllo positivo C- o N per controllo negativo e con 1, 2, 3 i campioni.

(Dnasi termoresistente)

Temperatura e tempo di incubazione:

50°C per 3 - 5 ore

oppure

37°C per 6 - 12 ore ed eventualmente fino a 24 ore

Lettura:

Presenza di termonucleasi: viene svelata dalla comparsa di un alone rosa intorno al dischetto.

Assenza di termonucleasi: mancata comparsa dell'alone rosa. Il terreno rimane blu scuro intorno al dischetto.

Il controllo positivo deve presentare l'alone rosa.

Il controllo negativo non deve presentare alcun alone.

Norme di sicurezza

RICERCA DELLA COAGULASI (sec. Kit Merck)

La coagulasi è un esoenzima, di natura proteica, che agisce sul fibrinogeno presente nel plasma trasformandolo in fibrina.

Tale reazione ha luogo dopo che la coagulasi si è legata con un fattore (CRF) presente nel plasma di alcuni animali (ad esempio il coniglio).

La prova viene eseguita per confermare l' identificazione di colonie sospette di Staphylococcus aureus sviluppatesi su terreni selettivi.

La prova si esegue con plasma di coniglio ed una brodocoltura del ceppo in esame.

Schematizzando:

Plasma + brodocoltura S. aureus PLASMA COAGULATO (prova positiva)       

Materiale e reattivi necessari:

provette da sierologia 8x80 o simili, se possibile sterili

parafilm per tappare le provette

pipette automatiche da 100 e 300 microlitri, se possibile utilizzare puntali sterili

plasma di coniglio (ossalato o con EDTA) liofilizzato che viene reidratato alcuni minuti prima dell'esecuzione della prova, secondo le istruzioni presenti sulla confezione.

Brodocoltura fresca del microrganismo in esame, di solito si utilizza una brodocoltura in Brain Heart Infusion di 18 - 24 ore di incubazione.

Procedimento:

prelevare 0,3 ml ( = 300 microlitri) di plasma di coniglio e porli nella provetta da sierologia

tappare bene con parafilm

agitare bene, anche per inversione in modo da omogeneizzare bene plasma e brodocoltura

incubare a 37°C per 1 - 4 ore .

se dopo 4 - 6 ore l'esito della prova è negativo, prolungare l'incubazione e ripetere il controllo dopo 24 ore.

RICERCA DELLA COAGULASI

Lettura:

per il controllo della coagulazione inclinare ogni ora la provetta da un lato con cautela (NON AGITARE)

Positività della prova: il test viene considerato positivo quando il contenuto della provetta per due terzi coagulato

Negatività della prova: se non si ha la formazione di alcun coagulo (il plasma rimane fluido) o se si ha la formazione di un coagulo troppo piccolo.

CONTROLLO DI QUALITA'

Per confrontare le risposte del test eseguito su campione incognito, o per controllare la validità del kit in uso, è possibile eseguire test che diano risposte sicuramente positive o negative. Allo scopo è necessario utilizzare:

come controllo positivo una coltura di S. aureus coagulasi positivo (ATCC 25923)

come controllo negativo il terreno liquido sterile nel quale si è sviluppata la coltura

( Brain Heart Infusion);

una coltura di S. epidermidis coagulasi negativo (ATCC 12228)

TEST SU VETRINO

Il test della coagulasi può essere eseguito su vetrino utilizzando una goccia di plasma di coniglio e una colonia sospetta.

La formazione di piccoli coaguli visibili ad occhio nudo indica la positività della prova. Tale test mette in evidenza il cosiddetto clumping factor ( detta anche coagulasi legata) e non la coagulasi libera del test in provetta. Esso pertanto può servire come screening orientativo e deve essere confermato dal test in provetta.

N.B. Il test su vetrino può dare false risposte positive e fenomeni di autoagglutinazione.

RICERCA DELIA BETA-GALATTOSIDASI (TEST ONPG)

La fermentazione del lattosio è uno dei test classici per l'identificazione di molti

microrganismi. La metodica abituale si basa sulla dimostrazione della produzione

di acido dopo che il disaccaride è stato scisso in glucosio e galattosio dall'enzima

beta-galattosidasi. E' tuttavia necessario che il lattosio possa penetrare all'interno della

cellula grazie all'azione di una specifica permeasi, affinchè la scissione possa avvenire.

Il ruolo della permeasi e della beta-galattosidasi è fondamentale per la classificazione dei microrganismi in:

Il test ONPG permette di mettere in evidenza la presenza dell'enzima beta-galattosidasi

indipendentemente dalla presenza dell'enzima permeasi. In altre parole è possibile

distinguere i lattosio fermentanti lenti (che possiedono la beta-galattosidasi) dai non

fermentanti il lattosio (che non possiedono la beta-galattosidasi).

Il reattivo utilizzato è il galattoside sintetico Orto-NitroPhenil-β-D

Galattopiranoside, (ONPG) che non necessita di permeasi per penetrare nella cellula

e che viene idrolizzato dai microrganismi come il lattosio.

Poiché il gruppo orto-nitrofenolo è cromogenico, quando l'ONPG viene scisso in

soluzione alcalina si forma una soluzione gialla.

Schematizzando:

Il test consente di differenziare i lenti fermentanti dai non fermentanti ad es: Citrobacter(onpg +) da Shigella (onpg -) .

RICERCA DELIA BETA-GALATTOSIDASI (TEST ONPG)

Procedimento

1. In una provetta trasferire 0,2 - 0,3 ml di soluzione fisiologica

2. Porre nella soluzione un disco di ONPG, prelevato, in asepsi, con pinzette

perfettamente asciutte e pulite

3. Prelevare la colonia in esame ed emulsionarla con cura nella soluzione fisiologica

contenente il disco ONPG

Incubare a 37°C per 6 ore, esaminando la sospensione ogni ora.

Prova positiva: la comparsa di una colorazione gialla dopo 1-6 ore di incubazione indica

la presenza dell'enzima β-galattosidasi. la colonia del microrganismo in esame appartiene

quindi ad un lattosio fermentante

Prova negativa: la sospensione rimane incolore dopo 6 ore. E' opportuno incubare tale

sospensione fino a 24 ore per rilevare i lattosio fermentanti tardivi. Trascorso tuttavia

tale periodo di tempo la prova si considera negativa e quindi il microrganismo non

possiede la β -galattosidasi ed è un non fermentante il lattosio.

Norme di sicurezza