La colorazione istologica, citochimica e istochimica

La colorazione istologica, citochimica e istochimica

Il fine è quello di aumentare il contrasto dei componenti morfologici cellulari o tessutali affinché ne risulti una migliore analisi microscopica, oppure quello di identificare e localizzare specifiche sostanze chimiche all'interno di una cellula (citochimica) o di un tessuto (istochimica): in quest'ultimo caso si sfrutta la proprietà di alcuni reagenti di formare con specifici composti chimici contenuti in cellule e tessuti dei prodotti colorati (nel caso di microscopia ottica) o dei prodotti opachi agli elettroni (nel caso di microscopia elettronica).

I coloranti si classificano in acidi e basici in base al tipo di radicali ionizzabili delle macromolecole con cui essi si legano, e spesso sono mescolati insieme in miscele per evidenziare più costituenti contemporaneamente.

Acidi: presentano gruppo cromoforo acido (anionico). Vi si legano componenti che hanno affinità per gli acidi (acidofili), cioè basi, i cui gruppi ionizzabili sono principalmente gli amminici. Coloranti acidi sono l'eosina, l'Orange G, il Light Green, la fucsina acida.

Basici: presentano gruppo cromoforo basico (cationico). Vi si legano componenti che hanno affinità per le basi (basofili), cioè acidi, i cui gruppi ionizzabili sono principalmente i carbossilici, gli ossidrilici, i solforici, i fosforici. Coloranti basici sono l'ematossilina, il blu di metilene, il verde di metile, la pironina.

NB: Acidofilia e basofilia dipendono dal pH della soluzione colorante:

Es. le proteine sono basofile a valori di pH superiori al punto isoelettrico (valore di pH al livello del quale il numero di cariche positive eguaglia quello delle negative), ma sono acidofile a valori di pH inferiori al punto isoelettrico.

Metacromasia = proprietà di alcuni composti chimici ad alto PM e contenenti molti gruppi anionici (come glicosaminoglicani acidi) di assumere con certi coloranti basici (come blu di toluidina) una colorazione diversa da quella del colorante impiegato: questi coloranti, di colore blu (ortocromatico) allo stato monomerico quando diluiti in soluzione, se si legano in gran quantità a un substrato, formando così dimeri e polimeri, appaiono di colore rosso (metacromatico) poiché assorbono la luce ad una lunghezza d'onda più bassa.

Le tecniche coloranti più comuni sono:

*Ematossilina eosina (EE) = l'ematossilina basica si lega a molecole acide conferendo colore blu violaceo; utilizzato per il nucleo e i ribosomi (ricchi di DNA E RNA), il RER, la matrice cartilaginea. L'eosina acida colora le sostanze basiche in rosso o rosa; utilizzata per il citoplasma (ricco di proteine basiche) e per le fibre collagene.

*Acido periodico-Schiff (PAS) = utilizzato per i polisaccaridi, consiste in un trattamento preliminare con acido periodico che ossida i glicidi 1,2-glicol o 1-ammino,2-idrossi degli zuccheri in gruppi aldeidici, i quali si combinano con il reattivo di Schiff (o leucofucsina, ottenuto trattando la parafucsina contenuta in fucsina basica con acido solforoso) formando un prodotto di colore rosso magenta. Sono PAS-positive la mucina delle cellule calciformi del sistema gastrointestinale e di quello respiratorio, le membrane basali, la cartilagine e il glicogeno.

*Colorazione tricromica di Masson = specifica per il tessuto connettivo, in particolare per il collagene. Colora nuclei e strutture basofile in nero (dall'ematossilina ferrica), collagene in verde o blu (rispettivamente dal Light Green e dal blu di anilina), il citoplasma e gli eritrociti in rosso (da fucsina acida + xylidine ponceau).

Alcian blu = colora in blu i mucopolisaccaridi acidi e i proteoglicani acidi. Vira al verde se associato con van Gieson.

*van Gieson = utilizzata per vasi sanguigni, campioni di cute, e tessuto connettivo in cui il collagene è rosso (dalla fucsina acida), i nuclei sono blu o neri (rispettivamente da Emallume-Celestin blue e da ematossilina ferrica), il citoplasma e gli eritrociti sono gialli (da fucsina acida + acido picrico) e l'elastina è in blu (se eventualmente si associa un colorante specifico per quest'ultima, come ad esempio la soluzione di Weigert).

*Giemsa & Wright = utilizzato per gli elementi del sangue e di altre cellule in striscio. Colora i nuclei di blu scuro o violetto (dal blu di metilene), il citoplasma di blu chiaro, (sempre dal blu di metilene), e gli eritrociti di rosa pallido (dall'eosina).

*Colorazione tricromica di Goldner = usata per distinguere l'osso mineralizzato dall'ostoide (non mineralizzato), colora i nuclei (di osteoblasti, osteociti, osteoclasti e cellule del midollo) di nero (dall'ematossilina ferrica), il collagene di verde (dal Light Green), il citoplasma di rosso (da fucsina acida + xylidine ponceau), gli eritrociti di arancio (dall'Orange G).

Impregnazione con Argento/Oro = i prolungamenti neuronali e gliali si colorano di marrone, nero, o oro.

Metodo di Nissl o blu di metilene = consiste nell'utilizzo di un colorante basico (come la tionina) per colorare di blu gli acidi nucleici, in particolare l'RNA citoplasmatico contenuto nei ribosomi liberi e nel RER. Talvolta vengono evidenziati degli aggregati che vengono appunto chiamati sostanza di Nissl.

Sudan nero/Osmio = usati per strutture contenenti lipidi poiché vi si solubilizzano, danno una colorazione nera. In particolare l'osmio viene utilizzato in microscopia elettronica poiché è in grado di fissare i lipidi depositandosi nelle membrane plasmatiche, rendendole perciò elettrondense (post-fissazione in tetrossido di osmio).

Orceina = colora di marrone le fibre elastiche e i cromosomi.

*Azan = usato per il tessuto connettivo e per componenti citologici dei tessuti epiteliali, colora i nuclei di rosso (dall'azocarminio), il collagene, la membrana basale e la mucina di blu (dal blu di anilina), il tessuto muscolare e gli eritrociti di arancio (dall'Orange G).

Blu di toluidina = usato per la colorazione di sezioni semifini (1 μm) e per lo studio dei glomeruli e dei nervi, lega anche i granuli dei mastociti. Sebbene normalmente colori di blu, in particolari condizioni (ad esempio in paraffina) vira al rosso per metacromasia.

*Verde di metile-Pironina = per mostrare contemporaneamente DNA e RNA, la cromatina (contenente DNA) si colora di verde (dal verde di metile), mentre il nucleolo e le zone basofile del citoplasma (contenenti RNA) si colorano di rosso (dalla pironina).

*Reazione di Feulgen = specifica per DNA, che appare di colore rosso porpora (cromatina e cromosomi) mentre il nucleolo ed il citoplasma rimangono incolori: prima si sottopone la sezione ad idrolisi acida con acido cloridrico, affinché si scinda il legame glucosidico purina-desossiribosio e si liberi così il gruppo aldeidico del desossiribosio, che viene quindi trattato con il reattivo di Schiff.

sono miscele.