CONTEGGIO DEI COLIFORMI

I coliformi sono batteri a forma bastoncellare, appartenenti alla famiglia delle Enterobatteriaceae, Gran negativi, asporigeni, aerobi ed anaerobi facoltativi, capaci di crescere in presenza di sali biliari Possiedono una β-galattosidasi che li rende capaci di fermentare il lattosio con produzione di acido, d aldeide e di gas in 24-48 ore a temperature comprese tra 32° e 37°C.

Sono abitualmente svelabili con le prove dei coliformi i seguenti generi: Escherichia, Citrobacter, KIeF siella, Enterobacter.

COLIFORMI FECALI

La denominazione «Coliformi fecali» fu introdotta successivamente a quella dei coliformi per evidenzia le specie di probabile provenienza fecale.

I costituenti del gruppo (Escherichia coli, Klebsielia sp), oltre a rispondere alle caratteristiche comuni tutti i coliformi devono possedere la capacità di fermentare il lattosio con produzione di acido e di ga5 dopo una incubazione di 24-28 ore a temperature più elevate di 37°C, aggirandosi, a seconda delle metodiche, tra i 44 e i 44,5°C.

Il saggio positivo dei coliformi fecali ha valore di indicatore fecale certamente più significativo di quel] dei semplici coliformi, in quanto è supponibile che la maggiore rappresentanza nel gruppo sia sostenuta dagli stipiti di Escherichia coli.

La presenza di coliformi fecali, pur non rappresentando una prova certa, può far presupporre la presenza di altri microrganismi di derivazione intestinale, tra i quali non è esclusa la presenza di patogeni, anche s nessuna informazione si può trarre sul numero e sulla identità di questi. L'importanza della determinazione dei Coliformi negli alimenti è soprattutto quella di valutare l'efficacia dei trattamenti c bonifica operati e di mettere in evidenza eventuali ricontaminazioni avvenute dopo i trattamenti stessi Molto importante è anche valutare la presenza di Coliformi ai fini della salubrità delle materie prime dei semilavorati per i quali non è previsto un trattamento di bonifica finale.

Infine, la presenza di Coliformi in acque telluriche, non sottoposte ad alcun trattamento, è un elemento negativo nel giudizio di potabilità.

La ricerca dei batteri Coliformi e la valutazione della loro concentrazione numerica è definita colimetria La colimetria è un test basilare in microbiologia alimentare e ambientale, che viene condotto quasi si ogni singolo campione, in quanto, come già detto può fornire una utilissima informazione circa la igienicità dei campione e delle manipolazioni da questo subite. Può essere eseguita:

1) con il metodo dei conteggio diretto su terreno solido;

2) con il metodo M.P.N. in terreno liquido;

3) con il metodo delle membrane filtranti.

CONTEGGIO DIRETTO (INCLUSIONE)

La ricerca e la numerazione dei batteri Coliformi viene, con questo metodo, eseguita su terreno solido. Il terreno è il Violet Red Bile Agar (Difco) sul quale i Coliformi danno delle colonie incluse di color rosso porpora, circondate da un alone dovuto alla precipitazione dei sali biliari. Il terreno contiene miscele d sali biliari con acidi biliari liberi che inibiscono gli Streptococchi D, e cristalvioletto che completa l'azione inibitoria nei confronti dei batteri gram⁺ e ancora degli streptococchi D.

Tecnica:

la tecnica impiegata è quella dell'agar-germi:

- al fondo di due piastre si pone 1 ml del campione intero o diluito;

- si versano, in ogni piastra, 12-15 ml di terreno fuso e raffreddato a 47⁰C;

- si mescola bene e si lascia solidificare;

- a solidificazione avvenuta, sulla superficie di ogni piastra si versano ancora 5-6 ml di terreno.

Il campione resta così incluso nello strato più profondo del terreno. A causa della scarsa diffusione dell'ossigeno atmosferico si creano condizioni di anaerobiosi, nelle quali la fermentazione dei carboidrati presenti porta ad una maggiore produzione di cataboliti acidi, che rende più marcato il viraggio dell'indicatore ed il colore rosso delle colonie dei Coliformi.

L'incubazione delle piastre fa fatta a 37⁰C per 24 ore.

Dopo il tempo di incubazione si contano le colonie caratteristiche delle piastre rappresentative; il loro numero moltiplicato per il reciproco della diluizione (se il campione è stato diluito) esprimerà il numero di Coliformi per grammo o per ml di prodotto.

Le piastre che vengono prese in considerazione per il conteggio sono quelle che hanno un numero di colonie fino a 150 per campioni non diluiti e 15-150 per i campioni sottoposti a diluizione.

CONTEGGIO M.P.N.

Il campione deve essere liquido o opportunamente diluito.

Il terreno impiegato può essere diverso a seconda del campione in esame. (Per l'acqua si usa Lactose Broth, per il latte pastorizzato Brilliant Green Bile 2 %.

COLIMETRIA DELL'ACQUA POTABILE

Tenendo conto della capacità di tutti i coliformi di fermentare il lattosio con produzione di acido e di gas, si usa un terreno di coltura contenente questo zucchero, come il Lactose broth (Difco) o altro terreno simile. La prova consta di due tempi: nel primo si valuta la presenza di batteri fermentanti il lattosio, nel secondo tempo si stabilisce se la fermentazione è dovuta a batteri coliformi e se questi sono Coliformi tipici (fecali) o se invece sono atipici (tellurici).

Tecnica:

Il terreno, brodo lattosato, va preparato a doppia concentrazione. Si allestiscono: i beuta con 50 ml di terreno + 50 ml di campione. Una serie di 5 provette con 10 ml di terreno + 10 ml di campione. Sia nella beuta che nelle provette vengono preliminarmente inserite le campanelle di Durham, che raccoglieranno il gas derivante dall'eventuale fermentazione.

Si incuba in termostato a 36 ± 1^°C per 48 ore.

La presenza di una bolla nella campanella di Durham e di minuscole bollicine che dal fondo vanno verso la superficie, dopo leggero scuotimento, indicano la positività della prova.

PROVA DI CONFERMA PER I COLIFORMI TOTALI

Da ogni provetta o beuta che, dopo il tempo di incubazione presenta produzione di gas si preleva 1 ml che viene inoculato in 10 ml di Brilliant Green Bile 2 %, con campanella di Durham, e incubato per 48 ore a 36 ± 1 ⁰C. Il terreno adoperato contiene ancora lattosio, ma in più contiene anche bile che inibisce i gram⁺, mentre invece non esercita alcun effetto inibitorio sugli Enterobatteri. In base al numero delle prove confermate si cerca il valore che sarà riferito a 100 ml di campione.

I Coliformi nell'acqua destinata al consumo umano devono essere ASSENTI

PROVA DI CONFERMA PER I COLIFORMI FECALI

Per stabilire se la fermentazione è dovuta a coli di origine fecale, di cui il rappresentante tipico è Escherichia coli, si conduce contemporaneamente alla prova esposta il seguente test:

- da ogni provetta o beuta che presenta produzione di gas, viene prelevato i ml e inoculato in 10 ml di EC Medium con campanella di Durham. Si incuba a 44,5 ⁰C + 02 in bagnomaria per 24 ore.

Le prove positive presentano produzione di gas e il numero di coliformi fecali/100 ml di campione viene ricavato dalla tabella M.P.N.

CONTEGGIO CON MEMBRANE FILTRANTI

Quando la ricerca degli indici di contaminazione fecale (coliformi, coliformi fecali, streptococchi fecali) viene eseguita su campioni di materiale liquido (acque potabili, gassate, ecc.) e l'assenza ditali indici viene richiesta in volumi elevati (100 ml o più), è conveniente, per ragioni pratiche ed economiche, usare il metodo della filtrazione su membrana porosa.

Tale metodo consiste nel filtrare, per mezzo di una pompa da vuoto, un quantitativo predeterminato del liquido in esame o diluizioni del medesimo, su membrana di cellulosa con porosità di 0,45 micron di diametro. La membrana viene deposta dopo la filtrazione su piastre di terreni selettivi appropriati, evitando accuratamente la formazione di bolle d'aria. Dopo incubazione, per tempi e temperatura convenienti, si contano le colonie tipiche formatesi sulla membrana procedendo, ove se ne ravvisi l'opportunità, alle solite prove di conferma.

In genere si usano terreni con poteri selettivi sufficienti per rendere superflua la prova di conferma.

Terreni da usare

Coliformi totali

Agar di Endo in piastre da 60 mm di diametro. Le piastre, tenute al buio e in frigorifero, si conservano per due settimane.

A filtrazione avvenuta, deporre le membrane sul terreno evitando la formazione di bolle. Incubare le piastre a 35⁰C ± 1 per 22-24 ore in termostato. Su questo terreno, le colonie dei coliformi appaiono di colore rosa e rosso scuro con riflessi metallici.

Ai fini della numerazione dei coliformi in 100 ml, si utilizzano, per il conteggio le piastre con un numero di colonie tipiche s a 80, e per i campioni diluiti le piastre con un numero di colonie tipiche non inferiori a 20 e non superiore a 80 e con un numero di colonie totali (tipiche e non) non superiore a 200.

Per calcolare il numero di coliformi per 100 ml, si applica la seguente formula:

n. di coliformi x 100 ml colonie tipiche contate x 100 / ml di campione filtrato

Per i campioni diluiti moltiplicare per il fattore di moltiplicazione.

Coliformi fecali

Agar m-FC: distribuito in ragione di 3-4 ml in piastre di Petri di 6 cm di diametro. Il terreno si conserva 96 ore al buio e alla temperatura di 2-10⁰C.

Le piastre contenenti la membrana si incubano in bagnomaria per 24 ore alla temperatura di 44,5⁰C ± 0,2.

La temperatura deve essere esatta e mantenersi costante, affinché sia selettiva.

Le colonie dei coliformi fecali sono di colore blu. Per la numerazione dei coliformi fecali in 100 ml, utilizzare piastre con un numero di colonie fino a 60, e le piastre con un numero di colonie tipiche fra 20 e 60 per i campioni diluiti ed applicare la formula esposta per i coliformi.

L' agar m-FC si prepara nel modo seguente:

sospendere 52 g di polvere in i litro di acqua distillata e scaldare ad ebollizione fino a soluzione completa.

Aggiungere 10 ml di soluzione di acido rosolico, preparato sciogliendo i g di acido rosolico in 100 ml di soluzione 0,2 N di idrato di sodio. Continuare a scaldare per i minuto. Raffreddare a 50⁰C e versare in piastre. Quando il terreno è ben solidificato, deporre sulla sua superficie le membrane inoculate.