Colorazione di Gram

Colorazione di Gram

OBIETTIVO: Saper esaminare un batterio utilizzando il metodo della colorazione semplice.

PRINCIPIO BIOLOGICO:

La colorazione di Gram ci permette di distinguere due grandi categorie di batteri: Gram positivi (Gram⁺) e Gram negativi (Gram^-) che hanno una composizione della parete batterica diversa.

Il colore caratteristico dei batteri Gram positivi è il viola, mentre quello dei batteri Gram negativi è il rosso. I batteri Gram positivi hanno la parete spessa composta da peptidoglicano, che rende la parete impermeabile a vari trattamenti utilizzando vari coloranti, quali:

• Violetto di Genziana;
• Fucsina Basica;
• Reattivo di Lugol che visualizza il colore all'interno;
• Alcool;
• Acqua distillata.

Morfologia dei batteri.

Il modo più semplice e comune per osservare la forma e l'aspetto dei batteri è quello di ricorrere all'allestimento di preparati microscopici colorati al loro esame mediante il microscopio ottico. I batteri manifestano 3 forme generali:

Sferica;

Cilindrica;

Ricurva

Le cellule sferiche o ovali sono dette cocchi. Quelle cilindriche o a bastoncino sono dette bacilli, mentre le forme ricurve sono dette vibrioni. Quando presentano un aspetto cilindrico incurvato e numerose curve sono detti spirilli.

Le cellule figlie spesso non si separano al termine della divisione, ma rimangono attaccate dando origine ad aggregati di cellule dette colonie.

I batteri con maggiore varietà di dispersione delle colonie sono i cocchi:

Questi si possono presentare come diplococchi quando le cellule rimangono attaccate a due a due;

Gli streptococchi quando le cellule rimangono attaccate a formare grappoli;

Le sarcine quando formano aggregati geometrici di tipo cubico.

Le cellule batteriche presentano strutture fondamentali che sono la parete, la membrana plasmatica, la massa citoplasmatica e materiale nucleare.

MATERIALE UTILIZZATO:

1.vetrino porta-oggetti;

2.ansa;

3.becco Bunsen;

4.batterio;

5.pinza di legno;

6.colorante violetto di genziana;

7.colorante fuxina basica;

8.olio di cedro;

9.pipetta;

10.bacchette di vetro;

11.vaschetta di plastica;

12.acqua distillata contenuta nella spruzzetta;

13.microscopio;

14.alcol;

15.reattivo di Lugol.

PROCEDIMENTO:

L'esperienza ha avuto inizio prendendo l'uso di un vetrino porta-oggetti; al centro del vetrino è stata posta una goccia di acqua distillata. In contemporanea è stata presa una vaschetta di plastica aventi tra i due bordi, due bacchette di vetro; successivamente il vetrino è stato posato sopra le due bacchette poco distanti tra loro in modo da poter sorreggere quest'ultimo.

Arrivati fino a questo punto si è avuto inizio dell'esperienza procedendo con le fasi qui sotto elencate:

Distensione.

In un secondo tempo si è preso l'uso dell'ansa, una bacchetta di ferro avente la punta ripiegata a cerchio; la punta dell'ansa è stata sterilizzata ponendola sopra la fiamma del becco Bunsen, ed in seguito la si è fatta raffreddare; approfittando di questo momento, con la punta dell'ansa, si  è potuto prelevare una piccola parte di batterio, contenuto in un piccolo contenitore, e la si è posta sopra il vetrino.

Essiccamento.

In questa fase il vetrino è stato posto sopra la fiamma del becco Bunsen mediante l'uso della pinza di legno; il vetrino viene così posto da poter fare dei movimenti rotatori affinché quest'ultimo si asciughi.

Fissazione.

Il materiale ( batterio ) posto sopra il vetrino è stato aderito con il vapore prodotto facendo passare il vetrino nella fiamma per tre volte.

Colorazione.

In quest'ultima fase il vetrino, ormai asciugato, è stato posato tra la due bacchette di vetro, poste sempre sopra la vaschetta; si è preso l'uso del violetto di genziana, cioè un colorante basico, il quale, con l'uso di una pipetta, è stato versato sopra il vetrino cui è stato fatto agire per un minuto, poi sono state versate gocce di colorante di Lugol e mettendo a contatto entrambi i coloranti, si è aspettato un altro minuto facendo in modo che quest'ultimo abbia potuto penetrare in tutte le cellule. Fatto ciò, si è potuto eliminare il colorante eseguendo la pulitura del vetrino facendo uso prima dell'alcool (nelle cellule Gram positive non entra, mentre in quelle negative porta via il colorante) e poi dell'acqua distillata contenuta nella spruzzetta ed il liquido posto sopra ad esso è stato gettato all'interno della vaschetta. Successivamente è stato asciugato il vetrino sulla parte alta della fiamma del becco Bunsen, poi si è utilizzato la fuxina basica ponendola sopra ad esso e aspettando un minuto affinché il liquido possa estendersi, si lava ancora una volta con il l'acqua distillata ed asciugata nuovamente con il becco Bunsen.ed infine è stata eseguita l'analisi al microscopio, con obiettivo 100, obiettivo a immersione al quale tra la lente e il vetrino viene interposta una goccia di liquido ad alto indice di rifrazione e cioè, in questo caso, olio di cedro.

CONCLUSIONI:

Svolta questa esperienza posso concludere che il procedimento è stato effettuato in un primo tempo con una parte di procedimento dell'esame a fresco e l'altra utilizzando i procedimenti della colorazione semplice, e cioè:

distensione

- essiccamento;

- fissazione;

- colorazione.

OSSERVAZIONI:

Posso sicuramente affermare che nei coloranti si sono evidenziati  dei microbi, i quali sono per la maggior parte Gram positivi, e quindi abbiamo avuto a che fare con gli streptococchi perché le cellule sono rimaste attaccate formando grappoli.