MAPPA CONCETTUALE

INTRODUZIONE

Capitolo 1 LA NASCITA DI UN'IDEA

LE MUTAZIONI E LA MUTAGENESI ARTIFICIALE

DAL DNA ALL'INGEGNERIA GENETICA

Capitolo 2 COME LE CELLULE CAMBIANO

STORIA DELLA TRASFEZIONE

COME FUNZIONA

Capitolo 3 IN PRATICA .

CELLULE HeLa E UBIQUITINA

IL PROTOCOLLO

I RISULTATI

Capitolo 4 O.G.M. E PROBLEMI

UNA DEFINIZIONE

BENEFICI E RISCHI

BREVETTARE I GENI?

BILIOGRAFIA

SITOGRAFIA

L'argomento di questa tesina riguarda il percorso compiuto dalle biotecnologie per giungere alla creazione degli O.G.M., dalla definizione del concetto di mutazione agli inizi del '900, fino alla scoperta delle tecniche che ne permettono il controllo e l'applicazione.

Grazie a uno stage compiuto questa estate presso i laboratori di ricerca del centro di oncologia molecolare IFOM ho avuto l'opportunità di osservare in prima persona un metodo per la produzione di organismi geneticamente modificati all'interno della ricerca sui tumori e le loro cause.

Oltre ai loro utilizzi terapeutici, come in questo caso, gli O.G.M. possiedono moltissime altre potenzialità in molti ambiti, che tuttavia devono essere ancora correttamente valutate in rapporto all'effettiva e ai loro potenziali rischi per l'uomo e per l'ambiente.

Un aspetto del complesso dibattito è la polemica riguardante il problema dei brevetti, che oltre a sollevare molti dubbi etici, mette in evidenza come spesso la legislazione in questo settore sia più volta a favorire le grandi aziende multinazionali che il giusto utilizzo di queste tecnologie. 

LE MUTAZIONI e LA MUTAGENESI ARTIFICALE

Il termine mutazione in campo genetico venne introdotto la prima volta nel 1901 da Hugo de Vries, il quale, in seguito ai suoi studi sulla rapunzia europea, aveva notato come dei nuovi caratteri, non presenti nei genitori, comparissero all'improvviso nelle generazioni successive. De Vries ricondusse la comparsa di questi nuovi caratteri a improvvisi cambiamenti avvenuti all'interno dei geni e ipotizzò anche che tali modifiche potessero essere ereditarie.

Sempre nei primi anni del novecento Thomas Hunt Morgan e il suo Drosophila Group compirono il primo sfruttamento consapevole di mutazioni naturali con lo scopo di dimostrare il legame tra geni e cromosomi all'interno dei moscerini della frutta. Grazie a questi esperimenti Morgan riuscì a verificare la corrispondenza tra il colore bianco degli occhi e il cromosoma X, dimostrando come questa mutazione fosse più frequente nei maschi, compiendo esperimenti simili a quelli di Mendel con le piante di pisello.

Tuttavia le possibilità di raccogliere dati come quelli di Morgan erano molto scarse vista la scarsa frequenza delle mutazioni naturali e la loro difficile individuazione, quindi tra gli scienziati si iniziò a far strada l'idea di provocare artificialmente mutazioni all'interno degli organismi in modo da poterne studiare gli effetti e avere una maggiore quantità di casi osservabili. Nel 1927 Muller, un membro del Drosophila Group, arrivò alla conclusione che i raggi X in dosi massicce fossero in grado di provocare mutazioni indotte nelle cellule e che tali mutazioni fossero della stessa natura di quelle spontanee. Le sue tesi furono confermate da diversi esperimenti sulle cellule animali sia vegetali e portarono, all'inizio della seconda guerra mondiale, alla scoperta di altri agenti mutageni chimici, come il gas di mostarda.

Grazie alla mutagenesi artificiale vennero condotti gli esperimenti che portarono alla formulazione del famoso dogma un gene- una proteina e alla scoperta della coniugazione batterica.

DAL DNA ALL'INGEGNERIA GENETICA

Tuttavia l'uso dei raggi X o di altri agenti mutageni non consentiva di controllare i processi di mutazione o le loro conseguenze, per riuscire a farlo bisognava comprendere la struttura molecolare dei geni e il loro funzionamento. Nel 1953 Watson e Crick costruirono un modello di DNA a doppia elica, rendendo così possibile spiegare i meccanismi di duplicazione e di funzionamento del materiale genetico. Grazie a questa scoperta si posero le basi dell'ingegneria genetica, che consiste nel trasferire materiale ereditario da un organismo a un altro.

Edward Tatum suddivise l'ingegneria genetica in tre categorie: Eugenetica, cioè la ricombinazione di geni

esistenti, Ingegneria genetica, cioè la produzione di nuovi geni, e Ingegneria eufenica, cioè la modificazione o il controllo dell'espressione dei geni.

Negli anni '60 venne messa a punto una delle tecniche più importanti per la manipolazione del materiale genetico: il DNA ricombinante. La tecnica del DNA ricombinante sfrutta la capacità degli enzimi di restrizione, presenti nei batteri, di tagliare il DNA in punti precisi, in modo da creare segmenti che possono essere ricombinati e successivamente introdotti nelle cellule.

Grazie a questo metodo nel 1973 venne prodotto il primo O.G.M. moderno da Stanley Cohen E Herbert Boyer, che inserirono all'interno di un batterio Escherichia coli un gene clonato di rana.

Da allora sono stati creati molti prodotti ad uso commerciale derivati da O.G.M come l'insulina ricombinate, la somatostatina e diversi tipi di sementi, modificati per resistere al gelo e ai pesticidi.

LA STORIA DELLA TRASFEZIONE

I geni, una volta modificati, devono essere inseriti nelle cellule in modo da poter essere espressi.

I metodi più usati all'inizio furono l'uso della trasformazione batterica o di vettori virali.

La trasformazione sfrutta la capacità dei batteri di acquisire il DNA di altre cellule batteriche lisate attraverso la membrana cellulare, mentre i vettori virali consistono nell'infezione delle cellule da parte di virus contenenti il DNA da inserire. Queste tecniche tuttavia risultano molto imprecise e soprattutto l'uso dei virus può risultare difficile da controllare o pericoloso, visto il loro potere patogeno. D'altra parte, l'introduzione di DNA nelle cellule senza l'utilizzo di vettori appare impossibile visto che sia la membrana che il DNA stesso sono carichi negativamente.

Negli anni '70 vennero quindi messi a punto dei metodi per rendere il materiale genetico neutro grazie a sostanze chimiche e nel 1978 Graham e Van der Eb descrissero per la prima volta l'inserimento di geni in una cellula grazie a una soluzione di fosfato di calcio.

COME FUNZIONA

La trasfezione è un processo che permette di inserire artificialmente

e in modo stabile nei cromosomi una sequenza di DNA estranea. Questo processo può avvenire con la mediazione di soluzioni di fosfato di calcio, per elettroporazione,

si praticano aperture nella membrana cellulare grazie a scariche elettriche da cui il DNA entra, o con i liposomi.

Uno dei metodi più efficaci e sicuri è quello che utilizza i liposomi. I liposomi sono piccole membrane lipidiche che incapsulano il costrutto e, grazie alla loro struttura simile alla membrana, possono essere facilmente inglobate per endocitosi. I geni estranei possono quindi integrarsi con quelli del nucleo consentendo di ottenere una popolazione di cellule modificate.

CELLULE HeLa e UBIQUITINA

L'ubiquitina è una proteina prodotta da tutte le cellule eucariote. La sua funzione principale è quella di segnalare la presenza di proteine inutili in modo che possano essere riconosciute dal sistema di distruzione della cellula, legandosi ad esse. Sfruttando il suo ruolo di marcatore, svolge inoltre altri compiti importanti, come la direzione del trasporto delle molecole dentro e fuori la cellula.

A causa delle sue funzioni molto complesse una possibile anomalia nella produzione normale di ubiquitina potrebbe generare modifiche pericolose all'interno della cellula. Per capirne le conseguenze occorre creare una linea cellulare stabile con una sovrapproduzione della proteina.

Le cellule usate per l'esperimento sono cellule HeLa, cioè cellule provenienti dall'adenocarcinoma della cervice uterina, di cui si conoscono molto bene le caratteristiche.

Queste cellule vengono modificate in modo che possano produrre una quantità doppia di proteina, grazie all'inserimento nel loro nucleo di un costrutto, chiamato Flag- HIS-Ub, contenente il gene per la sintesi dell'ubiquitina.

IL PROTOCOLLO

Il costrutto Flag- HIS-Ub viene fatto entrare nelle cellule secondo la procedura:

In una provetta unire 3 μl di DNA (0.33 γ/ μl) all'Optimem fino a ottenere 100 μl di

soluzione

In una seconda provetta mettere 6 μl di Lipofectamine, la soluzione contenente i liposomi, e l'Optimem sempre fino a 100 μl di volume, lasciare 5 min a temperatura ambiente

Unire goccia-goccia la seconda soluzione alla prima e lasciare per 20 min a temperatura ambiente, per fare in modo che il DNA venga correttamente incapsulato

Preparare le piastre a pozzetti con le cellule togliendo il terreno e mettendo 800 μl di Optimem per ognuno

Aggiungere 200 μl di soluzione di DNA più il Lipofectamine in ogni pozzetto e lasciare per 4h

Dopo quattro ore la trasfezione dovrebbe essere avvenuta e, qualche giorno più tardi, si possono verificare i risultati al microscopio.

I RISULTATI

Le cellule modificate vengono colorate grazie a particolari anticorpi che si legano solo all'ubiquitina    presente nel citoplasma e al nucleo con un procedimento chiamato immunofluorescenza.

In questo modo si possono distinguere da quelle rimaste normali, in caso di trasfezione non riuscita, e confrontare con i campioni negativi.

Infatti, i campioni positivi appaiono rossi, mentre in quelli negativi si vedono solo i nuclei delle cellule colorati di blu.

Le cellule trasfettate vengono in seguito coltivate e usate per altri esperimenti.

UNA DEFINIZIONE

Le cellule che si ottengono con questi processi sono a tutti gli effetti degli O.G.M.

Con questa definizione si intendono degli organismi il cui patrimonio genetico è stato manipolato attraverso le tecniche dell'ingegneria genetica e che, oltre alle singole cellule, come in questo caso,

possono essere applicate anche ad altri organismi più complessi.

In questo modo si possono ottenere piante o animali con caratteristiche completamente diverse da quelle di partenza, oppure velocizzando notevolmente i risultati ottenibili precedentemente con i tradizionali incroci.

BENEFICI e RISCHI

Oggi gli organismi geneticamente modificati vengono prodotti e studiati principalmente in campo

medico-farmacologico e in campo agroalimentare.

Lo scopo è quello di ottenere piante o animali più adatti alle esigenze umane come, ad esempio,

batteri capaci di sintetizzare farmaci, piante più resistenti e produttive o animali d'allevamento con ritmi di accrescimento più veloci. Grazie a queste caratteristiche e ai loro vantaggi commerciali, gli O.G.M. potrebbero essere utili in molti paesi del Terzo Mondo afflitti da climi aridi o con condizioni di povertà.

Tuttavia la loro diffusione ha anche provocato un acceso dibattito sulla loro possibile pericolosità e sui reali vantaggi per i paesi in via di sviluppo. Infatti, molti pensano che gli O.G.M. possano causare nuove forme di allergie o, con il rischio di inquinamento genetico, distruggere la biodiversità degli ecosistemi. Oltre a questo si aggiungono i problemi etici sollevati da coloro che ritengono illecito modificare arbitrariamente il DNA degli esseri viventi, sconvolgendo così i tradizionali rapporti uomo-natura.

. BREVETTARE I GENI?

Il dibattito sui brevetti nacque ancora nel 1889 quando il commissario dell'ufficio brevetti stabilì che le piante coltivate artificialmente e ottenute per mezzo di incroci non potevano essere considerate invenzioni, in quanto ritenute comunque "prodotti di natura".

Tuttavia un organismo modificato o un gene e le proteine ottenute da questi si possono ritenere "prodotti di natura"?

La polemica scoppiò negli anni ottanta quando la Corte Suprema stabilì che il batterio capace di sciogliere il petrolio di Ananda Chakrabarty non era un prodotto di natura ma, un'invenzione umana e quindi brevettabile. Dopo questa sentenza un gran numero di industrie, università e ricercatori, rifacendosi all'ampia interpretazione del concetto di prodotto di natura-invenzione umana, hanno iniziato a brevettare geni, cellule staminali ed interi organismi modificati.

I dubbi etici sulla possibilità di brevettare geni sono stati risolti con il paragone con la produzione di sostanze chimiche sintetiche. Infatti, così come il brevetto sul procedimento di sintesi delle vitamine garantisce i diritti di commercializzazione al suo inventore, allo stesso modo bisognerebbe fare con i geni che permettono la produzione artificiale di farmaci, come l'insulina.

Con il Progetto Genoma gli scienziati hanno iniziato anche a richiedere brevetti anche sulle sequenze di DNA utilizzate come    marcatori o sonde geniche.

Questo ha sollevato altre controversie sia per motivi morali, sia perché il monopolio sui geni detenuto da pochi laboratori, come quelli dell'Università California, che è titolare di ben 1018 brevetti, potrebbe limitare la libera circolazione di idee tra i ricercatori.

Proprio per questo, dal 2001, le richieste di brevetti sono sensibilmente diminuite e alcuni sono stati anche ritirati, ad esempio quelli concessi dall'Unione Europea alla società Myriad sui geni che causano il tumore al seno.

Le autorità, però, devono ancora definire con esattezza i parametri per l'estensione dalla brevettabilità agli esseri viventi in modo da, non solo, salvaguardare gli interessi delle multinazionali o semplicemente mantenere l'ordine pubblico ma, anche tenendo conto delle questioni filosofiche, etiche e sociali, raramente tenute da conto in merito alla situazione.   

G. STIX, I padroni della vita da "Le Scienze" (marzo 2006)

H. CURTIS e N. SUE BARNERS, Invito alla biologia, Zanichelli

MARCHESE, MANCINI, GRECO, ASSINI, Stato e società, La Nuova Italia

P. ROSSI, Storia della scienza moderna e contemporanea - il secolo ventesimo 2, TEA

www.portaledibioetica.it

www.pianetachimica.it

it.wikipedia.org

www.biologiauniroma1.it

www.provinciaps.it

www.castelsangiorgio.com

www.terradinessuno.wordpress.com