La cN-II: Aspetti clinici e ruolo nel metabolismo degli analoghi dei nucleotidi

La cN II: Aspetti clinici e ruolo nel metabolismo degli analoghi dei nucleotidi

La 5 nucleotidasi citosolica II è coinvolta in processi metabolici fondamentali per la vita cellulare: appare chiaro, quindi, come alterazioni dell attività della cN-II possano avere conseguenze cliniche anche molto gravi.

I difetti nel metabolismo dei nucleotidi purinici molto spesso sono in grado di causare gravi disfunzioni a livello del sistema nervoso centrale. La sindrome di Lesch Nyhan, ad esempio, è una sindrome metabolico neurologica X linked recessiva causata dalla deficienza dell enzima HGPRT ipoxantina guanina fosforibosiltransferasi) coinvolto nella via di recupero dei nucleotidi purinici. I sintomi neurologici tipici della malattia sono: comportamento autistico, tendenza all automutilazione, spasticità dei movimenti e ritardo dello sviluppo. E' stato proposto che tali sintomi, nei pazienti in cui l enzima HGPRT è assente, siano causati da deficienze nella sopravvivenza e nello sviluppo dei neuroni dopaminergici, anche se non è ancora stato chiarito il meccanismo molecolare che starebbe alla base della sofferenza neuronale. Tessuti prelevati da pazienti affetti dalla sindrome di Lesch Nyhan presentano diverse alterazioni del metabolismo dei nucleotidi purinici, quali accumulo di P RibPP, aumento della velocità della sintesi de novo delle purine, eccessiva produzione ed escrezione di ipoxantina ed un aumento della velocità di turnover dei nucleotidi adenilici che provoca iperuricemia e nefropatia. Nei globuli rossi dei pazienti affetti da questa sindrome è stato rilevato anche un accumulo di 5 amminoimidazolo 4- carbossiamide ribonucleotide AICAR o ZMP , un intermedio della via biosintetica de novo dei nucleotidi purinici, nonché precursore dell IMP, che può in seguito essere convertito in AMP e GMP. La presenza di questo composto in cellule nelle quali non avviene la sintesi de novo dei nucleotidi è stata spiegata come una conseguenza dell aumento della sintesi di nucleotidi purinici tramite la via de novo in altri tessuti. Lo Z- riboside prodotto da reazioni idrolitiche in diversi tessuti può entrare all interno degli eritrociti dove viene rapidamente fosforilato a ZMP, ZDP e ZTP da parte dell adenosina chinasi. Lo ZMP, a causa della sua analogia strutturale con l IMP, può essere invece substrato della nucleotidasi citosolica II, della quale sono stati riscontrati livelli molto elevati negli eritrociti di pazienti affetti dalla sindrome di Lesch Nyhan e da altri disordini neurologici Pesi et al , 2000 . Nei tessuti periferici dei pazienti lo Z riboside circolante entra all interno dei globuli rossi dove viene fosforilato. Nei polmoni l emoglobina lega l ossigeno liberando così il 2 3 BPG il 2 3 BPG ha una maggiore affinità per la desossiemoglobina rispetto alla ossiemoglobina : in questo modo il 2 BPG, un potente attivatore della cN-II, può stimolare fortemente l attività della nucleotidasi, per la quale lo ZMP si è rivelato un buon substrato. L attività della cN-II sullo ZMP porta alla formazione dello Z riboside che può essere trasportato attraverso la membrana plasmatica e può attraversare la barriera emato encefalica, accumulandosi così all interno dei neuroni. È stato inoltre dimostrato che lo Z-riboside è un composto tossico capace di indurre apoptosi in un modello di cellule neuronali. Secondo questo modello quindi malattie neurologiche correlate a disordini nel metabolismo delle purine caratterizzati dall accelerazione della sintesi de novo di nucleotidi purinici) potrebbero essere causate dall accumulo e successiva idrolisi, da parte delle nucleotidasi, di intermedi della via biosintetica delle purine, con conseguente produzione di metaboliti tossici per le cellule nervose. Pesi et al. 2000) hanno dimostrato che in pazienti affetti da sindromi neurologiche i livelli di cN-II negli eritrociti sono più elevati rispetto ai controlli: l idrolisi del nucleotide ZMP un intermedio della sintesi de novo delle purine) porterebbe in questo caso alla formazione di un metabolita tossico Z-riboside) capace di indurre apoptosi delle cellule neuronali o comunque interferire con il loro differenziameto, causando così la comparsa dei sintomi neurologici e comportamentali che caratterizzano tali sindromi.

L importanza clinica delle nucleotidasi, e in particolare della 5 nucleotidasi citosolica II oggetto di questo studio, è data anche dal loro coinvolgimento nel metabolismo degli analoghi dei nucleotidi utilizzati in terapie antivirali o antitumorali.

Gli analoghi dei nucleotidi sono molecole strutturalmente simili ai nucleotidi utilizzati da cellule e virus per la replicazione del genoma: l utilizzo di questi antimetaboliti a scopo terapeutico punta quindi al blocco della trascrittasi inversa virale o della DNA polimerasi virale terapia antivirale) o al blocco della DNA polimerasi cellulare in cellule che abbiano subito una trasformazione verso il fenotipo canceroso terapia anticancro ; in alternativa, gli analoghi dei nucleotidi possono agire bloccando gli enzimi responsabili della sintesi dei precursori nucleotidici, sia attraverso la via biosintetica di recupero sia attraverso la via de novo. A prescindere dal livello della via biosintetica degli acidi nucleici con cui tali antimetaboliti vadano a interferire, il risultato sarà in ogni caso il blocco della replicazione del virus o della cellula cancerosa.

Gli analoghi dei nucleotidi vengono somministrati sotto forma di profarmaci: i pazienti assumono quindi l analogo nella forma nucleosidica che può essere trasportato all interno delle cellule per mezzo dei trasportatori presenti sulla superficie cellulare. Una volta giunto all interno delle cellule l analogo del nucleoside deve essere attivato, cioè fosforilato fino

alla forma trifosfato che può essere substrato della DNA polimerasi ed eventualmente essere incorporato nella catena nascente del DNA in fase di replicazione causando così il blocco della replicazione stessa Hunsucker et al , 2005 . In questo scenario le nucleotidasi agiscono contrastando l efficacia terapeutica del farmaco: gli analoghi fosforilati, infatti, possono essere substrato delle nucleotidasi che ne catalizzano il catabolismo producendo gli analoghi in forma nucleosidica, che possono in seguito lasciare la cellula per mezzo dei trasportatori di membrana. Dati provenienti da studi clinici o studi su linee cellulari e enzimi purificati suggeriscono quindi che le nucleotidasi possano avere un ruolo importante nei meccanismi di resistenza alle terapie con analoghi dei nucleotidi. L esistenza di cicli di substrato tra chinasi e nucleotidasi indica quindi che il rapporto tra attività chinasica e attività nucleotidasica è un fattore importante nel determinare il grado di attivazione del profarmaco. Oltre al catabolismo da parte delle nucleotidasi, la resistenza al farmaco può svilupparsi inoltre a causa di un calo di espressione dei trasportatori di nucleosidi presenti sulla membrana mancato ingresso del farmaco all interno delle cellule) o a causa del calo di attività degli enzimi attivatori del profarmaco.

Tra tutte le nucleotidasi, la cN-II riveste un ruolo molto importante nei meccanismi di resistenza ai farmaci: l enzima purificato può infatti utilizzare come substrato molti analoghi monofosfato, e la resistenza, sia in vitro che in vivo, è spesso correlata con alti livelli di espressione dell enzima. La cN-II umana ricombinante purificata è in grado di idrolizzare i seguenti analoghi fosforilati: 5 fluorodeossiuridina monofosfato FdUMP , AZTMP, CdAMP, D arabinofuranosilguanina monofosfato araGMP , E 2- bromovinil 2 deossiuridina monofosfato BVdUMP) e ddCMP, anche se la velocità di reazione varia tra l 1 e l 11% rispetto a quanto osservato con il substrato naturale IMP Mazzon et al , 2003 .

Gli analoghi dei nucleosidi sono particolarmente importanti nel trattamento di patologie ematologiche; i più sfruttati in questo campo sono l analogo pirimidinico citosina arabinoside araC , utilizzato per il trattamento di leucemie acute, e gli analoghi purinici 2- clorodeossiadenosina 2 CdA) e fludarabina, utilizzati soprattutto per il trattamento di patologie ematologiche di bassa gravità Galmarini et al , 2003a . Nelle linee cellulari cancerose, i livelli di cN-II vengono correlati con il grado di sensibilità della cellula verso gli analoghi citotossici purinici e pirimidinici: Galmarini et al. 2003a , ad esempio, hanno dimostrato che in pazienti affetti da leucemia mieloide acuta AML) i livelli di cN-II misurati prima dell inizio del trattamento) sono significativamente inferiori nei pazienti in grado di rispondere alla terapia con araC rispetto ai pazienti che mostrano resistenza al

farmaco. In pazienti che presentano una ricaduta della malattia dopo il trattamento inoltre è stato osservato che i livelli di cN-II sono aumentati dal momento della diagnosi. Questi dati, pur non dimostrando inequivocabilmente che alti livelli di espressione della cN-II sono direttamente coinvolti nella resistenza verso il farmaco araC, suggeriscono comunque un ruolo dell enzima nell attività di questo farmaco in vivo in pazienti affetti da leucemia mieloide acuta AML . In particolare, l efficacia terapeutica degli analoghi dei nucleotidi dipende dal rapporto tra attività degli enzimi attivatori del profarmaco e attività delle nucleotidasi: l attività citotossica della citabarina araC) in cellule leucemiche dipende quindi dal rapporto tra enzimi attivatori come la deossicitidina chinasi dCK) ed enzimi inattivanti come la cN-II Galmarini et al , 2003b . I livelli di espressione della dCK e della cN-II e il loro rapporto sono quindi forti e indipendenti fattori prognostici per l efficacia della terapia in pazienti affetti da leucemia acuta mieloide AML) trattati con araC: il maggiore grado di resistenza si osserva in pazienti che al momento della diagnosi presentano bassi livelli di espressione della dCK mancata attività dell analogo nucleosidico) ed elevati livelli di espressione della cN-II aumento dell inattivazione del farmaco; Galmarini et al , 2003b . Il meccanismo con il quale la cN-II determina resistenza alla terapia con araC non è stato tuttavia ancora chiarito, in quanto l enzima purificato non è in grado di utilizzare araCMP come substrato: è probabile quindi che i livelli alterati di espressione della cN-II osservati in pazienti in cui si sviluppa resistenza al farmaco possano modificare i livelli dei diversi pool deossiribonucleotidici intracellulari, instaurando in questo modo un meccanismo di resistenza indiretto verso la terapia con araC un aumento del pool di dCTP è stato ad esempio osservato in cellule araC resistenti con elevati livelli di attività della cN-II, suggerendo quindi che il ridotto utilizzo di araCTP nel DNA neosintetizzato possa spiegare la resistenza osservata; Lotfi et al , 2001 .

La correlazione tra i livelli di cN-II e l efficiacia terapeutica di alcuni analoghi dei nucleosidi è stata osservata anche in pazienti affetti da leucemia cronica: anche in questo caso, infatti, Kawasaki 1993) ha dimostrato che i livelli di attività della cN-II sono significativamente inferiori in pazienti che rispondono alla terapia con 2 CdA rispetto ai pazienti che mostrano resistenza al farmaco.

L attività fosfotransferasica associata alla nucleotidasi citosolica di tipo II può altresì essere implicata nell attivazione di alcuni analoghi di nucleosidi utilizzati a scopo terapeutico; questo è particolarmente importante per i farmaci che non risultano essere substrato di nessun enzima attivatore intracellulare. In quest ultimo caso quindi l attività fosfotransferasica diviene l unica in grado di attivare il farmaco promuovendo così la sua

efficacia terapeutica. Studi in vitro hanno dimostrato che gli enzimi 5 nucleotidasi citosolica II cN-II) e 5 nucleotidasi citosolica III cN-III) possiedono attività fosfotransferasica, ma solo la cN-II si è dimostrata efficace nel fosforilare alcuni analoghi di nucleosidi all interno delle cellule in vivo . Nonostante la capacità di fosforilazione di tali composti sia più bassa rispetto a quella del substrato naturale inosina , l attività fosfotransferasica della cN-II verso gli analoghi nucleosidici è abbastanza elevata da garantire i livelli di fosforilazione osservati nelle linee cellulari Hunsucker et el , 2005 .

La   nucleotidasi citosolica II è responsabile della fosforilazione, e quindi dell attivazione, di farmaci antivirali come ribavirina e viramidina figura 19; Wu et al ,

2005 . La ribavirina è l unico farmaco approvato attivo sia contro i virus a RNA che contro i virus a DNA: viene utilizzata quindi nella terapia contro il virus

_{respiratorio                     sinciziale,}

Figura 19 Struttura dell'adenosina e dei suoi analoghi viramidina e ribavirina (Wu et al , 2005)

l epatite C HCV , sindrome respiratoria

acuta e smallpox virus. La ribavirina è un anlaogo di ribonucleoside purinico che mostra analogie strutturali con inosina, guanosina e adenosina: per queste sue caratteristiche si è rivelata essere un farmaco molto potente capace di interagire con svariati enzimi virali o della cellula ospite che utilizzino nucleosidi o nucleotidi come substrati o cofattori. La ribavirina monofosfato RMP) è un potente inibitore della IMP deidrogenasi (IMPDH , capace quindi di causare la perdita del pool di nucleotidi guanilici intracellulari; le forme trifosfato del farmaco possono invece inibire gli enzimi della via biosintetica del DNA e possono agire anche come mutageni durante la replicazione del DNA virale. La viramidina risulta invece essere un profarmaco della ribavirina, in quanto, almeno in vitro, può essere convertita a ribavirina da parte dell adenosina deaminasi. La ribavirina richiede la fosforilazione in posizione ' per divenire farmacologicamente attiva: è stato dimostrato che l enzima cN-II, che a concentrazioni fisiologiche di attivatori ed inibitori catalizza prevalentemente la reazione fosfotransferasica, è in grado di fosforilare la ribavirina con un efficienza catalitica nettamente superiore a quella dell adenosina chinasi Wu et al ,

2005 . La fosforilazione cN-II-dipendente della ribavirina potrebbe anche fornire una motivazione biologica per gli effetti collaterali della terapia con tale farmaco: i pazienti trattati con ribavirina mostrano infatti spesso anemia emolitica causata dall accumulo di ribavirina fosfato all interno degli eritrociti. In queste cellule è infatti particolarmente