PRINCIPI GENERALI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA

Il cardine della diagnosi eziologica delle malattie da virus è rappresentato dalla dimostrazione della presenza del virus o di sue tracce (antigeni, genoma) nell'organismo. Solo quando ciò nn è possibile è necessario la dimostrazione di una risposta immunitaria specifica mediante la ricerca nel siero del paziente della comparsa (sieroconversione) o dell'aumento di titolo degli anticorpi specifici x il virus.

DIMOSTRAZIONE DELLA PRESENZA DI VIRUS NELL'ORGANISMO

1. PRELIEVO DEL MATERIALE PATOLOGICO

Il successo delle indagini dipende dall'invio in laboratorio del materiale giusto prelevato al momento giusto.

- La scelta del materiale giusto dipende dal sospetto clinico, sulla base della localizzazione principale dell'infezione. Il materiale da esaminare sarà rappresentato da:

un campione di muco naso-faringeo nelle localizzazioni delle vie respiratorie;

dal liquor nelle forme meningee;

dal liquido vescicolare negli esantemi vescicolari;

dal materiale fecale nelle varie forme cliniche in cui è possibile sospettare enterovirus.

Nelle infezioni generalizzate il virus va ricercato contemporaneamente nel muco naso-faringeo, nel materiale fecale e nel plasma o nei leucociti circolanti.

- Il momento in cui fare il prelievo, deve coincidere con il titolo + elevato di virus nel materiale, e ciò si ha al momento della prima comparsa dei sintomi.

- Un'altra precauzione da seguire è data dall'immediato trasferimento dei materiali, immersi in adatte soluzioni tampone a temperature basse.

2. ISOLAMENTO DEL VIRUS IN COLTURE DI CELL E IDENTIFICAZIONE DEL VIRUS

-Giunto in laboratorio il materiale viene sospeso in soluzione tamponata, centrifugato x eliminare detriti cellulari e x ridurre la contaminazione microbica ed infine addizionato di antibiotici antibatterici ed antimicotici x eliminare la contaminazione batterica e micetica residua.

- Il materiale è pronto ad essere inoculato nelle colture di cellule adatte allo sviluppo del virus.

- Una volta che nelle colture cellulari compaia un effetto citopatico il liquido delle colture viene raccolto e si procede alla identificazione del virus -> si basa sullo studio dei suoi caratteri antigenici, x cui è necessario cimentare il virus (mediante tecniche sierologiche, le + usate sono reaazioni di neutralizzazione) con i sieri immuni nei confronti delle varie specie virali.

La scelta dei sieri con cui saggiare il virus è guidata da i caratteri del virus (tipo di effetto citopatico, presenza di inclusioni cellulari caratteristiche, tipo di cellule sensibili, presenza di proprietà emoagglutinanti), dalla situazione epidemiologica, dalla sintomatologia clinica.

3. METODI RAPIDI X LA DIMOSTRAZIONE DI VIRUS NELL'ORGANISMO

Oggi è possibile ottenere la dimostrazione della presenza di un virus in un adeguato materiale patologico in tempi molto brevi e con tecniche alla portata di molti laboratori:

a)     ricerca diretta di antigeni virali -> nelle cellule del materiale in esame, mediante reazioni di immunofluorescenza o altre tecniche immunocitochimiche;

b)     ricerca diretta di antigeni virali nel materiale patologico mediante tecniche radioimmunologiche o immunoenzimatiche

c)     ricerca diretta nel materiale patologico, della presenza di sequenze significative del genoma virale o di mRNA, mediante prove di ibridazione con sonde molecolari (sequenze nucleotidiche complementari a tratti specifici del genoma del virus) marcate con traccianti radioattivi. Si fa precedere l'impiego delle sonde da un'adeguata amplificazione delle sequenze nucleotidiche ricercate, mediante reazione di polimerizzazione a catena.

L'utilizzo delle tecniche rapide presuppone un preciso sospetto diagnostico sul virus.

- In alcune situazioni è possibile accorciare moltissimo il tempo necessario x la dimostrazione di un virus in colture,  ricercando nelle cellule della coltura la comparsa di antigeni virali precoci (senza attendere una replicazione virale sufficiente a dare un effetto citopatico, mediante reazioni di immunofluorescenza.

- In altre circostanze la ricerca diretta al microscopio elettronico possono essere uno strumento di indagine diagnostica nei confronti di virus che nn si moltiplicano in colture cellulari (parvovirus, rotavirus).

4. QUANTIFICAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI VIRALI A SCOPO DIAGNOSTICO E TERAPEUTICO

La possibilità di utilizzare reazioni di amplificazione degli acidi nucleici (P.C.R) con metodi quantitativi, consente la possibilità di dosare la quantità di acido nucleico virale presente x unità di volume in campioni di cellule o liquidi organici.

La quantificazione degli acidi nucleici virali (genomici) utilmente impiegata x la diagnosi di infezione in atto, tutte le volte in cui si desideri accertare la possibile "riattivazione" di un'infezione latente. Infatti se con una P.C.R. "quantitativa" il numero di molecole di genoma virale riscontrate x unità (n. di cellule) di materiale patologico esaminato, è significativamente superiore al valore di base presente nei soggetti infetti latentemente, ciò permette di dedurre la presenza di un'infezione "attiva" in atto (da riattivazione).

- Un'altra applicazione della quantificazione degli acidi nucleici virali (genomici) è rappresentata dal monitoraggio dell'andamento di un'infezione "persistente" in seguito ad un trattamento terapeutico. Nei pazienti affetti da AIDS, la quantificazione delle molecole di genoma virale (RNA virionico) presente in circolo, mediante P.C.R. "quantitativa", xmette la determinazione del "carico virale", ed è uno dei parametri x monitorare l'efficacia del regime terapeutico.

DIMOSTRAZIONE DI UN MOVIMENTO IMMUNITARIO SPECIFICO

La ricerca di anticorpi specifici x un determinato virus, ai fini della diagnosi di infezione in atto, deve essere eseguita con accorgimenti particolari, intesi a rilevare non solo la presenza di una risposta immune umorale specifica, ma la presenza di una risposta immune umorale indicativa di uno stimolo antigenico ancora presente nell'organismo. A tale scopo la ricerca di anticorpi deve essere condotta utilizzando una combinazione di una serie di particolari accorgimenti:

a)     dimostrazione di un aumento significativo (di almeno 3 diluizioni al raddoppio del siero in esame) del titolo anticorpale, in 2 campioni di siero prelevati a 8-10 giorni di distanza l'uno dall'altro.

b)     Ricerca di anticorpi specifici di classe IgM, che si producono precocemente nel corso di una stimolazione antigenica  perdurando in circolo x periodi molto brevi (4-6 settimane) dall'inizio dell'infezione.

c)     Ricerca di anticorpi specifici di classe IgG a bassa avidità presenti solo nelle prime settimane (3-4) dopo l'infezione.

d)     Ricerca di anticorpi nei confronti di antigeni virali precoci che inducano una risposta immune umorale limitata alle fasi iniziali dell'infezione.