MOLTIPLICAZIONE DEI VIRUS

I Virioni rappresentano la fase "dormiente", biologicamente inattiva, dei virus ma anche il prodotto terminale eliminato all'esterno della cellula infettata. Le diverse famiglie di virus utilizzano diverse strategie replicative, xchè costrette dalla differente organizzazione del genoma.

- La moltiplicazione dei virus avviene all'interno della cellula infettata:

il virus perde l'unità morfologica che caratterizza il virione nella fase extracellulare;

l'acido nucleico e le proteine strutturali della progenie virale vengono sintetizzate separatamente in un gran numero di copie che si uniscono in virioni maturi al termine del ciclo di replicazione.

- E' necessario che un virus infetti una cellula x potersi replicare. Lo "spettro d'ospite" definisce le varie specie animali che il virus può infettare e nelle quali può moltiplicarsi. Perché la malattia sia clinicamente avvertibile è necessario che l'infezione si trasmetta alle cellule bersaglio; in alcuni casi le cellule sensibili nel punto d'ingresso di infezione e le cellule bersaglio possono coincidere (ex infezioni respiratorie, infezioni erpetiche genitali, gastroenteriti).

- Perché l'infezione virale sia produttiva (completo ciclo replicativo) la cellula infettata sia sensibile e produttiva. Una cellula è permissiva quando offra le condizioni (fattori trascrizionali attivi) necessarie e sufficienti a consentire la completa trascrizione del genoma e la sintesi di tutte le proteine virus-specifiche. Perciò l'infezione virale può tradursi in:

▪ infezione produttiva → la cellula è sensibile e permissiva x la replicazione del virus

infettante, caratterizzata dalla produzione di una progenie virale

infettante.

▪ infezione restrittiva → quando la cellula sensibile presenta condizioni di permissività nn

costanti; in queste condizioni il virus infettante può rimanere a

lungo "inerte" e senza dare alcun segno della sua presenza nelle

cell infette, fino al momento in cui nn si ripristino condizioni di

permissività della cellula (ex l'infezione del parvovirus unamo

B19, che infetta esclusivamente le cell nucleate (precursori) della

serie eritroide, e si replica solo in coincidenza con un'attività

moltiplicativa della cellula ospite.

▪ infezione latente → quando il DNA del virus infettante si integra nel genoma della

cellula infettante (o si mantiene in forma episomica,

circolarizzata) replicandosi ad ogni ciclo cellulare (fenomeno

analogo alla conversione lisogena dei batteri). I virus che

producono infezioni latenti sono: i virus della famiglia degli

Herpesvirus e dei Retrovirus.

▪ infezione abotiva → quando una cellula sensibile non è completamente permissiva per

l'espressione di tutti i geni virali, così l'infezione si esaurisce

nella produzione di alcuni prodotti precoci virus-specifici senza

un ciclo completo di replicazione e senza la produzione della

progenie virale.

Le diverse fasi del ciclo di moltiplicazione virale:

attacco del virione alla superficie della cellula;

penetrazione del virus all'interno della cellula;

esposizione dell'acido nucleico virale

sintesi delle macromolecole virus specifiche;

montaggio dei virioni neoprodotti e liberazione della progenie virale.

ATTACCO DEI VIRUS ALLA CELLULA

Il contatto iniziale tra virus e cellula è il risultato di collisioni casuali. Poiché una collisioni si traduca in un attacco efficiente è necessario che una proteina presente sulla superficie del virione (antirecettore) collida con una struttura complementare (recettore) presente sulla membrana cellulare. Nei virus provvisti di peplos gli antirecettori sono in genere glicoproteine. La sensibilità di una cellula nei confronti di un particolare virus è definita e limitata dalla presenza di idonei recettori. Inoltre cellule sensibili possono essere non permissive (temporaneamente o permanentemente) impedendo il completarsi della normale infezione produttiva. Inoltre i recettori non si trovano alla superficie cellulare al solo scopo di permettere l'ancoraggio al virus, ma hanno altre funzioni; xciò l'antirecettore deve avere una struttura almeno in parte simile a quella del ligando fisiologico. Perciò fra tutti gli anticorpi che si producono nel corso di un'infezione virale nei confronti delle diverse proteine presenti nel virione, gli anticorpi diretti contro l'antirecettore virale sono quelli che risultano provvisti della capacità di neutralizzare la capacità infettante del virus. Può accadere che alcune specie di virus comprendano diversi tipi antigenici di virioni, differenziabili x essere neutralizzabili ad opera di differenti sieri immuni (pur ancorandosi alla cellula in corrispondenza dello stesso recettore).

- Spiegazione fra la presenza di un unico recettore sulla cellula sensibile e l'esistenza di diversi tipi antigenici differenziabili:

1) l'antirecettore virare è situato in una depressione (canyon) della molecola proteica virale, la quale è perfettamente raggiungibile dalla molecola che funziona da recettore sulla cellula ma che è inaccessibile alle molecole anticorpali. Xciò l'attività neutralizzante nn risiede negli anticorpi prodotti contro gli epitopi che coincidono con la zona antirecettoriale ma negli anticorpi che agiscono contro gli epitopi situati al bordo del canyon (bloccano l'accesso x il recettore cellulare).

2) ci sono casi (ex virus influenza) in cui il virus può modificare la sequenza amminoacidica della proteina antirecettoriale in modo da sottrarla all'azione di anticorpi neutralizzanti prodotti in precedenza, senza alterare la possibilità dell'antirecettore di interagire con la stessa molecola recettoriale.

Concludendo: i virus che hanno un ampio spettro di ospite utilizzano come recettore strutture della superficie cellulare ampiamente diffuse; mentre virus con un ristretto tropismo di specie, di tessuto o di organo utilizzano come recettore strutture cellulari assolutamente peculiari.

PENETRAZIONE DEI VIRUS E ESPOSIZIOEN DELL'ACIDO NUCLEICO

Nel processo di penetrazione dei virus nelle cellule animali è necessario un certo grado di intervento attivo della cellula. La penetrazione è possibile solo a temperature ottimali x la cellula. La penetrazione si verifica quasi istantaneamente dopo l'attacco al recettore. Nel caso dei virus privi del peplos , si ha subito dopo il legame con il recettore, e sono traferiti all'interno del citoplasma contenuti in una vescicola endosomica. Il processo di internalizzazione favorisce la disintegrazione del capside e la liberazione del genoma nel citosol.

Nel caso di virus provvisti del peplos la penetrazione può avvenire:

x fusione dell'involucro lipoproteico direttamente con la membrana esterna e immediata liberazione del nucleo-capside nudo all'interno della citosol;

x introduzione in una vescicola endocitica e successiva fusione dell'inviluppo lipoproteico virale con la membrana della vescicola e liberazione del nucleocapside nel citoplasma. La fusione del peplos virale con la membrana citoplasmatica richiede l'intervento di specifiche proteine fusogene presenti nell'inviluppo del virione.

4) SINSTESI DELLE MACROMOLECOLE VIRALI

I virus dipendono dalla cellula x l'approvvigionamento di energia e dei precursori necessari alla sintesi delle macromolecole virali, ma anche x la fornitura di ribosomi e enzimi necessari alla sintesi proteica. Acido nucleico e proteine strutturali sono i solo materiali che devono essere sintetizzati ex novo x garantire la replicazione di qualsiasi virus, dato che i lipidi presenti in alcuni virus sono di origine cellulare e sono acquisiti dal virione durante il processo di formazione del peplos.

Oltre alle proteine strutturali, vengono sintetizzate anche proteine nn strutturali, costituite da enzimi coinvolti nella replicazione dell'acido nucleico virale e spesso da proteine con funzioni regolatrici (inibitorie) sulle sintesi macromolecolari della cellula ospite.

Infezione batteriofagica

Subito dopo l'infezione, ma prima della sintesi del DNA fagico, compaiono una serie di nuovi enzimi "enzimi precoci". Dopo l'inizio della sintesi di DNA, la sintesi degli enzimi iniziali o "precoci" si arresta e inizia la sintesi delle proteine "tardive", cioè le proteine dell'involucro proteico e del lisozima fagico.

Nella replicazione dei virus animali :

le diverse sintesi macromolecolari nn si presentano in una così rigorosa sequenza temporale. Sono "precoci" quelle proteine che vengono sintetizzate dopo l'esposizione dell'acido nucleico virale infettante e sono tradotte da RNA-messaggeri trascritti dal genoma del virus parentale. Le proteine precoci comprendono: a) enzimi necessari alla replicazione dell'acido nucleico virale;

b) le proteine che inibiscono le sintesi macromolecolari delle cell ospite.

Le proteine tardive: sono sintetizzate dopo la replicazione dell'acido nucleico virale e sono tradotte da RNA-messaggeri trascritti dall'acido nucleico virale neoformato. Esse comprendono:

a)     le proteine strutturali della progenie virale;

b)     le proteine con funzioni inibitorie silla sintesi delle macromolecole virus specifiche.

STRATEGIE REPLICATIVE DEI VIRUS

L'evento chiave della replicazione è rappresentato dalla sintesi delle proteine virali ad opera del macchinario proteico-sintetico della cell infettata.

Il virus deve presentate al macchinario proteico 1 o + mRNA che la cellula possa riconoscere come tali e tradurre nelle relative proteine.

nella cell eucariotica, gli mRNA vengono sintetizzati nel nucleo, x trascrizione del DNA ad opera della trascrittasi cellulare (RNA- polimerasi II, DNA dipendente) e dopo adeguata elaborazione sono trasferiti nel citoplasma dove vengono tradotti delle rispettive proteine. Quindi la cell eucariotica è priva degli enzimi in grado di sintetizzare mRNA x trascrizione di una molecola di RNA. Xciò solo i virus il cui genoma: a) sia formato da DNA;

b) sia in grado di raggiungere il nucleo;

c) possieda i necessari segnali x l'attacco dei vari fattori e

dell'enzima (trascrittasi) cellulare sono in grado di

utilizzare il sistema trascrittivi cellulare.

Tutti gli altri virus devo possedere delle trascrittasi virus-specifiche o dei ribovirus a genoma negativo; o presentarsi all'interno della cellula con un genoma già organizzato con un mRNA ( ribovirus a genoma positivo).

il macchinario della cell ospite è predisposto esclusivamente x la traduzione di messaggeri "monocistronici"; da ciò deriva il fatto che alcuni mRNA virali, che trascrivono + di un gene, vengono tradotti in un "poliproteina" che viene poi "tagliata" nelle varie proteine funzionali.

DEOSSIRIBOVIRUS

La sintesi dell'mRNA avviene sempre nel nucleo ad opera della trascrittasi cellulare, il nucleo cellulare è la sede della replicazione del genoma e dell'assemblaggio dei nucleo-capsidi. Fanno eccezione i poxvirus dove l'assemblaggio avviene nel citosol ad opera di una RNApolimerasivirale

genoma formato da 1 molecola di DNA bicatenario e lineare (poxviridae, herpesviridae,

adenoviridae.

genoma formato da 1 molecola di DNA bicatenario e circolare (papovaviridae,

haepadnaviridae).

genoma formato da 1 molecola di DNA monocatenario e lineare (parvoviridae)

1°) Gruppo : herpesviridae, adenoviridae, papovaviridae. Il nucleo-capside viene trasportato lungo il citoscheletro dal sito di ingresso fino in prossimità di un poro della membrana nucleare, dove alcuni fattori provocano la liberazione del DNA all'interno del nucleo. Qui il DNA virale viene trascritto dall'apparato trascittivo della cellula in una serie di mRNA. La trascrizione viene operata su ambedue le catene polinucloetidiche del genoma. Le proteine precoci sono proteine che consentono la replicazione del genoma (DNA-polimerasi virus specifica) o che interferiscono con le sintesi macromolecolari della cellula; le proteine tardive sono le proteine strutturali della progenie virale.

2°) Gruppo : poxvirus. Il genoma è formato da una molecola lineare di DNA bicatenario,i cui estremi sono legati covalentemente, ciò consente una denaturazione in forma circolare monocatenaria. Essi svolgono il processo di trascrizione e di sintesi macromolecolari nel citoplasma e devono possedere una trascrittasi virus-specifica presente nel virione infettante. La trascrizione iniziale del genoma virale avviene all'interno del core con la produzione di proteine precoci che consentano la definitiva esposizione del genoma virale e l'avvio delle successive tappe della replicazione. La duplicazione del genoma virale e la trascrizione dei messaggeri tardivi si produce una seconda serie di sintesi proteiche che comprende enzimi e proteine strutturali che concorrono a formare i virioni. Il ciclo morfologico dei poxvirus si svolge esclusivamente nel citoplasma.

Manca riassunto di pag 535-544

RIBOVIRUS

▪ ribovirus a genoma positivo → genoma formato da una molecola di RNA monocatenario, lineare che ha la stessa polarità dell'mRNA e che funziona da messaggero immediato dopo la penetrazione nella cellula bersaglio. Non è presente alcuna trascrittasi virale. Le sintesi macromolecolari e l'assemblaggio dei nucleocapsidi avvengono nel citoplasma;

▪ retrovirus → genoma diploide formato da 2 identiche molecole di RNA monocatenario e lineare. L'RNA genomico pur di senso positivo nn è in grado di funzionare da messaggero e deve essere trascritto (dalla trascrittasi cellulare e nel nucleo) a partire da un intermedio a DNA, complementare all'RNA genomico, sintetizzato ad opera della trascrittasi inversa presente nel virione. Il montaggio del nucleo-capside ha luogo nel citoplasma.

▪ ribovirus a genoma negativo → il gene è formato da 1 o + molecole di RNA monocatenario e lineare. La trascrizione del genoma è necessaria x la formazione di mRNA, avviene nel citoplasma, ad opera di una trascrittasi virale presente nel virione. Nel citoplasma avvengono replicazione del genoma e il montaggio.

▪ reovirus→ unici virus con genoma formato da 10-12 molecole di RNA bicatenario. La trascrizione del genoma è necessaria x la formazione dell'mRNA e avviene nel citoplasma, ad opera di una trascrittasi virale presente nel virione. La replicazione e l'assemblaggio ha luogo nel citoplasma.

MONTAGGIO DEI VIRIONI E LIBERAZIONE DELLA PROGENIE

Una volta che siano prodotte un numero sufficiente di copie del genoma virale e delle differenti proteine strutturali, ha inizio il processo di montaggio dei nuovi virioni. Intervengono sia proteine strutturali che alcune con attività enzimatica. Nel caso:

.virus con capside isometrico, l'assemblaggio del capside in una struttura morfologicamente evidente precede l'ingresso del genoma virale nell'involucro proteico (procapside) che viene completato successivamente. Si possono osservare capsidi vuoti.

Quando i virus con capside isometrico sono sprovvisti di peplos, i virioni neoformati si accumulano nella sede di assemblaggio, formando ammassi cospicui che assumono un aspetto di formazioni cristalline. In questi casi la liberazione del virus nell'ambiente esterno avviene con la morte e la lisi della cellula infettata. Nel caso in cui i virus sono provvisti di peplos: il montaggio definitivo richiede l'intervento di una membrana cellulare, ciò è contemporaneo alla fuoriuscita del virione dalla cellula infettata. 1 o 2 proteine virali (glicosilate) si inseriscono in una zona della membrana periferica, dislocando alla periferia le proteine cellulari e rimanendo ancorate ad un'altra proteina virale che attraversa la membrana. Il nucleo capside virale, migra in prossimità di questa zona di membrana e si ancora direttamente o tramite la proteina M (matrice) dei virus con capside a simmetria elicoidale alla porzione citoplasmatica della proteina trasmembrana e viene avviluppato dalla membrana, liberandosi attraverso un processo di gemmazione. I virus provvisti di peplos, il danno cellulare è meno drammatico.

DURATA DEL CICLO REPLICATIVO

Ossia il tempo che intercorre tra l'infezione di una cellula e la comparsa della progenie virale matura, è estremamente variabile nei diversi gruppi di virus. Nel caso dei parvovirus, il ciclo replicativo può variare a seconda della fase del ciclo cellulare in cui si trova la cellula al momento dell'infezione. Ex nella famiglia Herpesviridae il ciclo replicativo può variare dalle 18-20 ore delgi alfaherpesvirus ai 3-4 giorni dei betaherpesvirus.

Perciò la durata del ciclo replicativo è proporzionale alla complessità e alle dimensioni del genoma ed oscilla da poche ore (6-7)nei picornavirus a 24 ore o + nei virus di > dimensioni.

ANTIGENI VIRUS-SPECIFICI

Le proteine virus-specifiche sono provviste di determinanti antigeni peculiari e funzionano come antigeni nell'organismo infetto, stimolandone la reazione immunitaria. Essi sono riconoscibili come antigeni all'interno delle cellule infette e rappresentano uno strumento diagnostico x accertare la presenza di un'infezione virale. Nel corso di un'infezione virale, antigeni virus-specifici sono identificabili in tutti i compartimenti cellulari in cui avvenga la sintesi o l'accumulo di proteine virsu-specifiche. Si possono distinguere:

antigeni nn strutturali -> presenti nella cellula nelle fasi precoci del ciclo di

moltiplicazione virale;

antigeni strutturali      -> la cui presenza è un evento tardivo.

BATTERIOFAGI

Sono parassiti dei batteri.

Sono costituiti da proteine e acido nucleico: nella > parte dei casi a DNA BC, talvolta DNA MC o RNA MC.

Presentano basi anomale: 5-idrossimetilcitosina al posto della citosina e 5-idrossimetiluracile al posto della timina.

Struttura: 6 tipi morfologici ->

tipi A,B,C, -> simmetria binaria con testa poliedrica e coda lunga con guaina contrattile (A); coda lunga senza guaina (B), coda corta (C); Il tipo A è quello + complesso: testa poliedrica, collare con 6 sottili propaggini, una formazione tubulare cava avvolta da una guaina contrattile, una piastra esagonale con spine ad ogni angolo connessa con 6 lunghe fibre (organi di attacco x i recettori della parete batterica),

tipi D,E > sono a simmetria icosaedrica; il tipo (D) è di grandi dimensioni, mentre (E) è di piccole.

Tipo F -> appartengono i fagi filamentosi.

Infezione della cellula batterica

Adsorbimento e penetrazione → l'adsorbimento avviene x attacco specifico ai siti recettoriali del batterio. Alcuni fagi si adsorbono solo se nel terreno è presente L-triptofano. Nei batteri Gram - i recettori si trovano nella membrana esterna della parete cellulare. Il batteriofago T4 con fibre caudali si lega a recettori LPS, con il ripiegamento delle fibre la piastra basale si abbassa e viene a contatto con la superficie batterica e l'adsorbimento è irreversibile. La guaina si contrae, la coda penetra parzialmente e il DNA viene rilasciato nel citoplasma.

Modificazioni metaboliche cellulari →anche i virus batterici devono far sì che i meccanismi biosintetici cellulari siano interrotti, fanno eccezione i fagi filamentosi con DNA MC che venfogo replicati senza influenzare la crescita batterica. In molti casi si ha la degradazione degli mRNA virali, la sintesi si DNA, RNA, proteine cellulari cessa.

Replicazione virale → la replicazione degli acidi nucleici nei batteriofagi varia a seconda della loro natura: DNA o RNA, BC o MC. Un ex classico di replicazione di fago a DNA BC è data dal fago T4, ospite di E.Coli il cui genoma è costituito da una lunga catena di DNA. Nel DNA virale possono essere presenti diversi siti di origine, ciò porta alla formazione di numerose copie di DNA che poi vengono tagliate da una endonucleasi x dare origine a segmenti di DNA fagico. X la trascrizione degli mRNA i batteriofagi utilizzano a volte polimerasi batteriche, modificate da proteine virali precoci.

Lisogenia → quando un batterio viene infettato da un fago si possono avere 2 eventi:

1°) le particelle del virus si replicano, lisano la cellula batterica e

fuoriescono;

2°) dopo la penetrazione il genoma si circolarizza e con un meccanismo

di crossing-over si intergra in 1 o + siti specifici del cromosoma

batterico. I batteriofagi che oltre ad avere un normale ciclo litico

con produzione di nuovi virioni, si integrano nel DNA cellulare in

uno stato di "profago" si definiscono "temperati",mentre i batteri

che li contengono sono detti "lisogeni" e il fenomeno "lisogenia". I

fagi che possono produrre solamente un ciclo litico sono detti

"virulenti". Il passaggio dallo stato di profago a quello litico è

regolato dal genoma virale attraverso una produzione di repressori

della replicazione del DNA fagico e la loro inattivazione.

Trasduzione → i batteriofagi posson trasferire alcuni geni da un batterio ad un altro. Ciò può avvenire in seguito a:

un ciclo litico (trasduzione generalizzata) x incorporazione nel capside fagico di un frammento di DNA batterico;

un ciclo lisogeno (trasduzione specializzata) quando il profago distaccandosi dal cromosoma batterico mediante un crossover sbagliato, assume un segmento di DNA delle cellula ospite.

6) Converisione fagica → alcuni batteri assumono nuovi caratteri fenotipici quando vengono lisogenizzati. Questi sono dovuti a geni magici che nn risentono della regolazione repressiva. Ex produzione di tossina da parte di alcuni batteri Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Streptococcus pyogenes.