LABORATORIO DI BIOLOGIA

Qual è lo scopo dell'esperimento?

Lo scopo dell'esperienza è verificare la variazione di assorbanza utilizzando del sangue non ossigenato e ossigenandolo sempre più, ma, per imparare a usare lo spettrofotometro, si è svolta una parte precedente l'esperienza vera e propria, utilizzando invece del sangue, una soluzione di permanganato di potassio (KMnO₄); e comprendere il rapporto esistente tra l'assorbanza e della trasmittanza in funzione della sua concentrazione, utilizzando lo spettrofotometro(il quale è in grado di misurare l'assorbanza o la trasmittanza di una soluzione ad una lunghezza d'onda definita dall'utente).

Sono stati utilizzati i seguenti materiali:

STRUMENTI:

bilancia centesimale elettronica

bacchetta di vetro

spruzzetta

Imbuto

Carta da filtro

Spettrofotometro

Pompa a vuoto

VETRERIA:

Un becher di diverse capacità

Matraccio

Pipetta

Cuvette standard

COMPOSTI:

• Permaganato di potassio (KMnO₄)
• Acqua distillata

ALIMENTI:

• Fertilizzante con sangue di bue

Si è proceduto nel modo seguente:

INTRODUZIONE

LA LUCE:

La LUCE è un fenomeno fisico consistente nell'emissione o riflessione da parte di un corpo di onde elettromagnetiche aventi una lunghezza tale da essere percepite dall'occhio umano. Le onde elettromagnetiche possono essere straordinariamente corte o avere una lunghezza d'onda molto grande; il nostro occhio è sensibile a onde elettromagnetiche comprese in un piccolo intervallo di lunghezze d'onda e in tale intervallo riesce a distinguere i colori, dal rosso al violetto. Le onde immediatamente esterne all'intervallo visibile sono dette infrarosse se la loro lunghezza d'onda è maggiore di quella del rosso, ultraviolette se la loro lunghezza d'onda è minore di quelle del violetto; il nostro occhio non riesce a vedere queste radiazioni.

LO SPETTROFOTOMETRO

Lo spettrofotometro è uno strumento che serve a confrontare le intensità delle radiazioni luminose di due sorgenti su una medesima lunghezza d'onda nelle varie parti dello spettro. La parola spettrofotometria, infatti, può venire divisa in "spettro", in quanto fa incidere una luce di frequenza ben precisa, e "fotometria" intesa come parte dell'ottica che riguarda la misurazione delle grandezze fisiche relative a radiazioni luminose. Lo spettro, invece, può essere definito come il risultato, sotto forma di figura o diagramma, dell'analisi delle componenti di una radiazione ondulatoria, in funzione di una grandezza caratteristica della radiazione stessa, quale la frequenza, la lunghezza d'onda, l'energia o la velocità. Lo spettro di assorbimento che si andrà a calcolare è l'insieme delle radiazioni monocromatiche che una sostanza è capace di assorbire.

A tal proposito si ricordi la legge di Lambert e Beer la quale afferma che la quantità di luce è proporzionale allo spessore della soluzione, alla concentrazione e alla natura della soluzione medesima. 

Il termine assorbanza può venire definito come quantità di luce assorbita oppure come l'opposto del logaritmo della trasmittanza.

L'assorbanza è l'opposto del logaritmo della trasmittanza o la capacità di una soluzione con una certa concentrazione di assorbire luce di una certa lunghezza d'onda, la trasmittanza è la capacità di trasmettere questa luce.

L'assorbanza e la trasmittanza non dipendono dal tipo di soluzione, ma dalla concentrazione di essa, infatti:

T = 10^-KSC

A = log(T)

A = - K S C

A = K C

T(Trasmittanza) S(Spessore costante) A(assorbenza) C(Concentrazione)

Da questa uguaglianza si nota come valga la legge sopra citata di Lambert e Beer, difatti essendo "K" una costante l'assorbanza dipenderà dalla concentrazione e dallo spessore della celletta. Nel caso della prova eseguita quest'ultimo dato rimaneva costante quindi ciò che influenzava sull'assorbanza era la concentrazione.

Nelle cuvette una parte del raggio viene trasmessa e una parte viene assorbita dal liquido in esso contenuto. Quelle utilizzate nella prova avevano uno spessore di 1 cm e una capacità di 3 ml. La parte del raggio trasmesso sarà minore di quello assorbito.

La trasmittanza viene indicata con "T" e la legge che la descrive è la seguente :

I₀ ----------> SOLUZIONE ------------> I_t

I_t / I₀ = 10 ^-KSC T

Dove con I_t e I₀ si intende rispettivamente il raggio in uscita e quello in ingresso.

Gli elettroni (in questo caso in una soluzione) si muovono intorno ad un nucleo positivo: l'energia totale dell'elettrone è la somma dell'energia cinetica e dell'energia potenziale. L'energia totale deve avere valori precisi, distinti, ossia quantizzati: gli elettroni occupano regioni dello spazio corrispondenti a livelli energetici quantizzati. Se salta a un livello energetico superiore, l'elettrone assorbe energia; se passa a un livello energetico inferiore emette energia. Le variazioni di energia restano ben determinate e sono pari alla differenza di energia tra i vari livelli. L'elettrone assorbe sempre una quantità di energia quantizzata. L'emissione di energia da parte dell'elettrone determina le radiazioni che formano lo spettro di assorbimento. Così un atomo con elettroni non eccitati si dice allo stato fondamentale, un atomo con elettroni che occupino un livello energetico superiore a quello normale si dice allo stato eccitato.

funzionamento dello spettrofotometro:

Lo spettrofotometro permette di misurare l'assorbanza o la trasmittanza di una soluzione grazie ad un sistema di fotocellule collegate ad un galvanometro, che misurano delle onde luminose di una lunghezza specifica che non vengono assorbite dalla soluzione contenuta nella provetta.

Queste onde vengono, emesse dallo spettrofotometro, vengono convogliate da un diaframma attraverso un filtro colorato che smorza la loro intensità, infine attraversano la soluzione e arrivano alla fotocellula.

UTILIZZO DELLO SPETTROFOTOMETRO:

L'assorbanza di una soluzione va confrontata con quella di una soluzione posta da noi a 0 (taratura), dunque:

Selezionare una lunghezza d'onda utilizzando l'apposita manopola;

Inserire la soluzione neutra, il "bianco" (nel nostro caso H₂O distillata);

Controllare che l'interruttore sia posto su Assorbanza;

Utilizzando la manopola Assorbanza/Trasmittanza, porre l'assorbanza del bianco a 0.00, oppure la trasmittanza a 100%;

Togliere il "bianco", inserire la provetta campione;

Leggere sul display l'assorbanza.

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ESPERIMENTO

Assorbanza del permanganato di potassio:

Per poter notare un'effettiva variazione di assorbanza utilizzando lo spettrofotometro, occorre operare con soluzioni molto diluite, si è utilizzata quindi una soluzione 0,03 N di permanganato.

Nel seguente modo:

• è stato calcolato il peso molecolare del KMnO₃ che risulta essere: Pm =39,1 g/mol +54,9 g/mol +16 g/mol * 3 = 158 g/mol; trovando così il peso equivalente P_eq = 158 g/mol / 5 = 31,6 g/mol.
• Poi è stato trovato il numero di equivalenti:               n_eq = N * V = 0,004 mol/l * 0,001 l = 0,003 mol.
• Infine è stata trovata la massa nel seguente modo:           m = P_eq * n_eq = 31,6 g/mol * 0,003 mol = 0,095 g.

E' stata pesata una massa di 0,095 g di KMnO₄ ed stata diluita inin 100 ml d'H₂O distillata presa dalla spruzzetta.

Procedendo come descritto sopra(UTILIZZO DELLO SPETTROFOTOMETRO) e variando lunghezza d'onda di volta in volta si è trovata quella che dava assorbanza massima e si è realizzato un grafico.

I dati sono stati raccolti in questa tabella:

L'assorbanza massima si è avuta per la lunghezza d'onda 520 nm, e avvicinandoci ad essa sono state effettuate misurazioni più precise.

Il grafico è il seguente:

Assorbanza e trasmittanza del sangue di bue:

Operiamo in modo analogo alla fase precedente, ma utilizzando il fertilizzante con sangue di bue.

Il fertilizzante è di colore marrone scuro e contiene altre sostanze in sospensione, perciò, perchè sia utilizzabile, è necessario filtrarlo.

Dopo aver preparato il filtro, messo nell'imbuto, filtriamo il fertilizzante e diluiamo 10 ml di filtrato in 100 ml di acqua distillata utilizzando la pro-pipetta.

Utilizzando lo spettrofotometro si ricavano i valori dell'assorbanza per il sangue non ossigenato.

Il massimo si ha per una lunghezza d'onda pari a 400 nm.

Elaboriamo quindi il grafico dell'assorbanza:

Dunque ossigeniamo utilizzando la pompa a vuoto e immettendo aria in essa la soluzione di sangue rimasta, ne preleviamo una parte ogni 2 minuti e misuriamo con lo spettrofotometro la sua assorbanza e la sua trasmittanza a 400 nm, che dà la massima assorbanza.

Dopo aver preso i dati, vengono messi nella seguente tabella:

Come si può notare, i dati sono incostanti, questo perchè lo strumento non è stato in grado di tenere la taratura con il bianco, eseguita prima di ogni misurazione. In questo caso, invece di porre l'assorbanza del bianco a 0.00, si è posta la sua trasmittanza a 100%.