La coltivazione dei batteri in laboratorio

LA COLTIVAZIONE DEI BATTERI IN LABORATORIO

FATTORI CHE CONDIZIONANO LA CRESCITA BATTERICA.

Le conoscenze delle esigenze nutritive dei diversi tipi batterici, nonché delle condizioni ottimali che ne favoriscono lo sviluppo in laboratorio, sono di notevole importanza per tutti i settori della ricerca batteriologica . Per crescere, tutti i microrganismi necessitano di idonee condizioni fisiche e chimiche, di adatte sostanze nutritive e dell'assenza di competitori antagonisti (chimici o biologici), che comunque possano interferire con le loro attività metaboliche. Com'è noto, in natura i microrganismi sono diffusi ovunque in quanto differenti tipi di batteri si sono adattati a crescere nelle condizioni più diverse; pertanto, in laboratorio devono essere ricreate le condizioni di volta in volta più adatte alla singola specie microbica che si intende studiare. Modificando opportunamente le concentrazioni delle diverse sostanze nutritive o cambiando le condizioni fisiche ambientali (eventi che si realizzano raramente in un habitat naturale), è possibile ottenere una crescita microbica ottimale, cioè ridurre al minimo il tempo di moltiplicazione.

I fattori che condizionano la crescita batterica possono essere suddivisi in due gruppi principali: i fattori nutritivi e i fattori ambientali. Per quanto concerne i primi, i microrganismi si distinguono in autotrofi e eterotrofi, a loro volta suddivisi in fotosintetici e chemiosintetici; riguardo al secondo gruppo di fattori, si possono trovare parassiti e saprofiti, tutti concetti già introdotti.

FATTORI NUTRITIVI.

I TERRENI DI COLTURA

Sebbene molti batteri possano crescere sul cosiddetto terreno minimo, che contiene semplicemente acqua, glucosio (quale fonte di carbonio), solfato di ammonio (quale fonte di azoto) e alcuni sali minerali, è pur vero che quasi tutti quelli di interesse medico necessitano di terreni colturali più complessi, arricchiti, cioè, di indispensabili fattori di crescita organici, quali amminoacidi, basi azotate e vitamine, che sono indispensabili per la sintesi di proteine, di acidi nucleici e per catalizzare le reazioni chimiche. Tali microrganismi, non potendo sintetizzare queste sostanze, devono, pertanto, trovarle nel terreno colturale.

Le esigenze nutrizionali della maggior parte dei batteri sono relativamente semplici. I primi microbiologi impiegavano il "brodo di carne" per coltivare i batteri in laboratorio, e questo è ancora oggi il substrato più usato, in quanto fornisce proteine per la sintesi delle componenti strutturali della cellula, carboidrati quale fonte di energia, oltre ad enzimi, vitamine, minerali e sali organici.

I terreni di coltura possono essere solidi o liquidi, a seconda della loro composizione.

Il terreno standard, attualmente impiegato in tutti i laboratori di batteriologia è il brodo nutritivo, composto da acqua, cloruro di sodio, estratto di carne, e peptone (derivato dalla digestione parziale di proteine animali). Questo terreno, così come l'abbiamo descritto, è liquido, ma può essere reso solido con l'aggiunta di agar (1,5-2%) e si ottiene così l'agar nutritivo.

Mentre i contaminanti ambientali crescono bene in questi terreni, la maggior parte dei batteri patogeni richiede terreni più ricchi, per cui l'agar nutritivo viene integrato dall'aggiunta di glucosio, di estratto di lievito (che apporta ulteriori fattori di crescita), vitamine, ed elementi minerali.

Nella diagnostica medica, soprattutto per il primo isolamento, è necessario arricchire l'agar nutritivo aggiungendo quelle sostanze che sono presenti nell'ambiente naturale di crescita del germe patogeno: il terreno più usato a questo scopo è l'agar-sangue, che contiene cioè anche sangue defibrinato, di equino o bovino. In alcuni casi, per favorire la crescita di particolari patogeni è necessario attuare un'operazione di scissione, mediante calore, dei globuli rossi del sangue addizionato al terreno colturale, al fine di rendere disponibile l'emoglobina per il batterio: l'agar-sangue trattato al calore assume un colora marrone, per cui tale terreno è stato chiamato agar-cioccolato.

L'agar nutritivo e i suoi derivati sono terreni colturali complessi a composizione chimica non definita, in quanto non è possibile conoscere l'esatta percentuale dei singoli ingredienti presenti nell'estratto di carne o nel peptone.

Per altri studi microbiologici è invece possibile impiegare terreni colturali chimicamente definiti (sintetici), in cui è nota la caratteristica chimica e la concentrazione degli ingredienti: i terreni speciali.

terreni speciali.

Per consentire indagini batteriologiche accurate e complete, e per facilitare il compito dei microbiologi che si dedicano all'isolamento e all'identificazione dei batteri di interesse medico, sono stati studiati particolari terreni che consentono, rispettivamente, di trasportare e conservare i batteri in condizioni di vitalità, oppure di isolare una singola specie da un campione biologico che ne contiene diversi tipi, o ancora, di identificare un batterio attraverso caratteri differenziali che vengono fatti esprimere su un determinato substrato. Questi particolari terreni sono descritti di seguito, in base alla loro particolare funzione.

1. Terreni da asporto: vengono utilizzati per la conservazione temporanea dei campioni, durante il loro trasporto al laboratorio di analisi. Questi terreni devono poter conservare la vitalità di tutti i microrganismi presenti, senza alterarne le reciproche concentrazioni. Sono in genere costituiti esclusivamente da soluzioni saline tamponate (che quindi si presentano in forma liquida); devono essere assenti carbonio, azoto e fattori organici di crescita, per evitare la riproduzione batterica. I terreni da trasporto per l'isolamento dei germi anaerobi devono inoltre essere privi di ossigeno molecolare.

2. Terreni ricchi: sono già stati descritti (agar-sangue e agar-cioccolato). Contengono particolari fattori di crescita (supplementi vitaminici, estratto di lievito) e prodotti biologici (sangue, siero), che consentono la riproduzione della maggior parte dei batteri di interesse medico, compresi i patogeni più esigenti. Sono terreni solidi.

3. Terreni di arricchimento: sono in genere terreni liquidi (brodi), che favoriscono, selettivamente, la crescita di un particolare microrganismo, che altrimenti verrebbe sopraffatto da altri batteri presenti in una miscela microbica. La particolare composizione di questi terreni favorisce, invece, una più rapida crescita del germe che si sta cercando. Tipico esempio è il brodo-selenite, usato comunemente per isolare le salmonelle o le shigelle da campioni di feci: la concentrazione di questi patogeni nel contenuto intestinale è infatti molto bassa rispetto alla normale popolazione degli altri batteri Gram-negativi. Il brodo-selenite mantiene la flora normale in fase di crescita stazionaria, mentre consente una moltiplicazione di tipo esponenziale dei patogeni citati.

4. Terreni selettivi: non si differenziano sostanzialmente, come principio, dai terreni di arricchimento. Si tratta però di terreni solidi, che contengono particolari sostanze capaci di inibire la crescita di alcuni batteri, consentendo, invece, lo sviluppo di altri. Per esempio, l'agar MacConkey e il terreno EMB (eosin methilene blue) contengono dei coloranti che inibiscono specificatamente la crescita dei batteri Gram-positivi, ma non quella dei Gram-negativi. Il terreno MSA (mannitol-salt-agar) contiene un'alta concentrazione di cloruro di sodio che consente solo la crescita degli stafilococchi, che sono alo-tolleranti.

Anche il terreno Sabouraud può essere considerato un terreno selettivo, in quanto, per il suo basso pH (5,6) e per il suo alto contenuto in zuccheri, consente la crescita di lieviti e muffe, mentre inibisce la crescita dei batteri. Altri terreni, ancora, sono resi selettivi mediante l'aggiunta di particolari antibiotici, che inibiscono la crescita dei batteri che vi sono sensibili.

5. Terreni differenziali: contengono indicatori che consentono di distinguere tra loro microrganismi differenti, sfruttando il diverso aspetto delle loro colonie cresciute su tali terreni solidi. Il terreno agar-MacConkey, per esempio, contiene lattosio e un colorante, che diviene rosso quando il pH scende al di sotto di 6,8. Pertanto, ogni microrganismo capace di fermentare il lattosio origina colonie di colore rosso; al contrario i batteri lattosio-negativi producono colonie incolori. E' così possibile identificare con facilità i patogeni Gram-negativi gastrointestinali, che raramente fermentano il lattosio e le cui colonie appaiono incolori sul terreno McConkey. Poiché la presenza del colorante in questo terreno inibisce, come già detto, i batteri Gram-positivi, L'agar-McConkey funziona come terreno sia selettivo, sia differenziale.

Lo stesso agar-sangue può fornire indicazioni utili alla differenziazione di alcuni microrganismi, in quanto può evidenziare la loro peculiare capacità di produrre tossine che scindono, in modo diverso, i globuli rossi (emolisine). Si può cioè osservare un alone chiaro e trasparente attorno alle colonie, se i batteri scindono totalmente i globuli rossi (beta-emolisi), oppure un alone chiaro e opaco se la lisi è parziale (alfa-emolisi); i batteri che non sono in grado di agire in questo modo sui globuli rossi presenti nel terreno colturale sono detti non-emolitici (gamma-emolisi).

FATTORI AMBIENTALI.

Per riprodursi, i batteri non necessitano solo di sostanze nutritive adatte, ma anche le condizioni ambientali devono presentare determinate caratteristiche. La temperatura, la disponibilità di ossigeno, il pH e la pressione osmotica sono tutti fattori che influenzano la sopravvivenza e la moltiplicazione dei batteri. Il livello di tolleranza di queste condizioni suggerisce in quale habitat il microrganismo può essere rinvenuto in natura. Lo stesso organismo umano o animale può essere considerato come un insieme di nicchie ecologiche, ciascuna delle quali ha le caratteristiche per fare moltiplicare un numero determinato di specie batteriche. In alcuni casi i germi patogeni sono così esigenti, per le loro condizioni di crescita in particolari tessuti od organi di un individuo, per cui può essere molto difficile e talvolta impossibile coltivarli in laboratorio, per la difficoltà a creare artificialmente lo stesso ambiente.

temperatura.

I batteri possono essere suddivisi secondo il livello di temperatura in cui possono crescere. In questi livelli ce n'è uno ottimo per la moltiplicazione di ogni specie, che in genere è molto prossimo al suo limite superiore di tolleranza. Al di sopra del limite superiore si osserva un arresto improvviso dello sviluppo. Questo fenomeno riflette il fatto che la temperatura influisce primariamente sugli enzimi della cellula: un aumento della temperatura accresce l'attività enzimatica consentendo una più rapida moltiplicazione cellulare; se la temperatura aumenta troppo, invece, gli enzimi destinati alla riproduzione della cellula vengono denaturati e quindi questa interrompe la sua moltiplicazione o addirittura muore.

I batteri possono venire inclusi in uno dei seguenti tre gruppi, in funzione del livello di temperatura in cui possono crescere.

1. Psicrofili (o criofili): sono microrganismi con un optimum di sviluppo intorno ai 15-20°C, ma che possono moltiplicarsi anche a 0°C o, in alcuni casi, anche a -7°C. Il loro habitat naturale è rappresentato dagli oceani e dalle regioni artiche e antartiche; inoltre sono in grado di svilupparsi nei cibi refrigerati e congelati.

2. Mesofili: preferiscono temperature tra i 20 e i 40°C. I patogeni dell'uomo e degli animali sono mesofili, adattatisi, cioè, alla temperatura corporea (circa 37°C) che, anche nel corso di processi febbrili, supera raramente i 40°C.

3.Termofili: la loro conzione di sviluppo si trova a temperature superiori ai 40°C. Gli habitat da cui si possono isolare tali batteri comprendono le sorgenti calde, i suoli tropicali, i sistemi di riscaldamento dell'acqua e le correnti calde di alcuni oceani. L'intervallo termico di quest'ultimo gruppo è stato recentemente elevato a 90°C, in quanto è stato dimostrato che alcuni batteri termofili, isolati da sorgenti calde possono in effetti crescere a tale temperatura (ancora più sorprendente la segnalazione di batteri capaci di crescere a temperature anche di 250°C). E' opportuno sottolineare che le molecole proteiche dei termofili differiscono da quelle dei mesofili, in quanto non vengono denaturate dalle alte temperature. La temostabilità di queste proteine è intrinseca, dipende, cioè, dalla composizione e dalla sequenza degli amminoacidi; quest'ultima è responsabile della comparsa di legami forti quali ponti disolfuro covalenti, e anche di molti legami idrogeno e di altri legami deboli, che stabilizzano la struttura delle proteine costitutive e degli enzimi.

Sebbene sia conveniente classificare i microrganismi in queste tre categorie in funzione della loro temperatura di sviluppo, in pratica non esistono marcate linee di separazione trai i vari gruppi batterici. Comunque, è importante sottolineare che i termofili non crescono affatto a 37°C, così come i mesofili non crescono a temperature di frigorifero, e poiché i microrganismi responsabili delle alterazioni degli alimenti sono appunto i mesofili, si spiega l'impiego delle basse temperature per la conservazione dei cibi stessi.

Le basse temperature, in genere, rallentano lo sviluppo dei batteri senza ucciderli. Anche il congelamento non uccide la maggior parte dei batteri presenti in campioni biologici o negli alimenti: quando la temperatura ritorna alle condizioni permissive, i microrganismi riprendono a moltiplicarsi. Comunque, alcuni batteri patogeni sono molto sensibili al freddo, per cui muoiono anche a seguito della semplice refrigerazione. Al contrario, un aumento della temperatura al di sopra di valori critici (nella maggior parte dei batteri, sopra ai 56°C) determina la denaturazione delle proteine, con conseguente morte della cellula.

ossigeno.

L'ossigeno contenuto nell'aria è di tale importanza per la vita, che molti ritengono non essere questa possibile in assenza di aria; l'ossigeno è infatti utilizzato per la respirazione, ossia per produrre l'energia necessaria alla cellula per il proprio metabolismo. In realtà esistono batteri che sono in grado di ottenere energia senza usare l'ossigeno allo stato gassoso (è stato introdotto il termine di  "fermentazione" per definire il particolare tipo di respirazione di questi microrganismi). I batteri per i quali, invece, la presenza dell'ossigeno atmosferico non solo non è richiesta, ma è talvolta addirittura dannosa, vengono denominati anaerobi, al contrario di quelli per i quali l'ossigeno è necessario, che si chiamano aerobi.

Inoltre, i batteri aerobi e anaerobi possono essere ulteriormente suddivisi in:

1. aerobi obbligati stretti (es. Micobatterium tubercolosis), ossia batteri che crescono solo in presenza di ossigeno atmosferico. La crescita di questi è facilitata se le brodo-colture sono continuamente tenute in agitazione, in modo da rendere sempre disponibile l'ossigeno;

2. anaerobi obbligati stretti, ossia batteri che possono vivere solo in assenza di aria e per i quali la presenza dell'ossigeno atmosferico risulta letale. Ricordiamo tra gli anaerobi i generi Bacteroides (costituenti principali di una normale flora microbica intestinale) e Clostridium. In questi ultimi anni si è osservato che esistono in grandissimo numero, nella flora microbica intestinale, batteri definiti ossigeno-intolleranti, ossia batteri che non soltanto non si sviluppano, ma muoiono entro breve tempo se vengono posti a contatto con tracce anche minime di ossigeno (es. Fusobacterium e Peptostreptococcus);

3. anaerobi facoltativi, ossia batteri che possono vivere anche in assenza di ossigeno atmosferico (cioè mediante metabolismo fermentativo), ma la cui crescita è notevolmente più rigogliosa in sua presenza. Gli anaerobi facoltativi comprendono molti generi di interesse medico (es. Vibrio, Spirillum, Aerobacter, Salmonella, Shigella fra i Gram-negativi; Staphylococcus e molti bacilli fra i Gram-positivi);

4. microaerofili, ossia batteri che possono moltiplicarsi in presenza di aria (20% di ossigeno), ma al contrario del gruppo precedente, crescono più rigogliosamente a concentrazioni inferiori (2-18%). Vi appartengono germi Gram-positivi quali Diplococcus, Streptococcus, Lactobacillus.

Il diverso comportamento dei batteri nei confronti dell'ossigeno molecolare è ben rappresentato dalla localizzazione della loro crescita all'interno di un terreno colturale liquido in provette da batteriologia. Gli aerobi si concentrano in superficie; gli anaerobi sul fondo; gli anaerobi facoltativi lungo tutta la provetta; i microaerofili circa a metà, tendenti verso la superficie.

Per isolare e studiare i batteri anaerobi stretti e ossigeno-intolleranti è necessario, pertanto, aggiungere ai terreni di trasporto e ai terreni di coltura particolari sostanze riducenti che neutralizzino l'ossigeno molecolare con cui vengono in contatto le cellule. Per proteggere dall'ossigeno questi microrganismi, durante le manipolazioni di laboratorio, si impiegano particolari cappe per anaerobiosi, nelle quali l'ossigeno viene sostituito da azoto o da altri gas inerti. Questa apparecchiatura è però indispensabile solo per i batteri ossigeno-intolleranti, che vengono uccisi anche da minime concentrazioni di ossigeno. Per tutti gli altri batteri anaerobi stretti si possono invece condurre tutte le operazioni in presenza di aria, mentre è poi indispensabile la loro incubazione in atmosfera priva di ossigeno per consentirne la moltiplicazione.

Gli anaerobi e i microaerofili sono ampiamente distribuiti in natura. Sono anche normali costituenti della flora microbica delle mucose di uomini e animali; nel contenuto dell'intestino sono addirittura più presenti rispetto agli aerobi in un rapporto di 1000:1.

ph.

Il pH, ossia il grado di concentrazione dell'idrogeno, condiziona anch'esso, e notevolmente, la crescita microbica. Anche se in partenza il terreno colturale viene regolato a pH 7, dopo lo sviluppo dei microrganismi si hanno variazioni verso valori acidi o basici, in dipendenza tanto della specie microbica, quanto della composizione del terreno colturale stesso. L'optimum di pH per molti batteri è compreso fra 6,5 e 7,5 e nei terreni colturali si aggiungono spesso sostanze tamponanti, al fine di mantenere il più a lungo possibile il pH ottimale di ogni specie microbica; infatti molti batteri producono, dalla demolizione delle sostanze nutritive che utilizzano, quantità di cataboliti (ossia prodotti di rifiuto) acidi così elevate da inibire la loro stessa crescita. I batteri non si moltiplicano generalmente a pH inferiore a 4,5, ma bisogna ricordare che anche a pH più bassi non sempre vengono uccisi. La maggior parte dei lieviti e delle muffe predilige invece l'acidità ed i relativi terreni di coltura devono essere regolati a pH compresi fra 4,5 e 6. Quest'ultimo rilievo consente di intuire che, regolando il pH a valori diversi (utilizzando, quindi, terreni definiti selettivi), si ottiene lo sviluppo prevalente di batteri piuttosto che di lieviti o muffe, e viceversa.

grado di umidità.

La presenza di acqua, non legata al terreno, è molto importante: ad esempio, l'agar al 2% lascia libera una quantità di acqua sufficiente per lo sviluppo dei batteri; l'agar al 15% lega quasi tutta l'acqua e lo sviluppo batterico è inibito. La presenza di acqua influenza, inoltre, fattori quali la pressione osmotica e la concentrazione salina, che condizionano lo sviluppo batterico. La pressione osmotica di un terreno dipende dalla concentrazione delle sostanze disciolte nell'acqua. Poiché l'acqua tende a muoversi dalle soluzioni meno concentrate a quelle più concentrate, la cellula batterica, immersa in una soluzione meno concentrata rispetto al suo citoplasma, tenderebbe, in assenza di adatti meccanismi di protezione come la parete cellulare, ad aumentare di volume fino a scoppiare. Essa, tuttavia, non solo limita l'assunzione di acqua, ma è in grado di emetterla, rispettando così la condizione indispensabile per l'assunzione dell'alimento e l'eliminazione delle scorie.

Per preparare una coltura, è quindi necessario tener conto di tutte le carattericstiche del microrganismo ricercato, al fine di rendere completamente favorevole le condizioni del suo sviluppo.

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TECNICHE DI COLTIVAZIONE.

Le indagini batteriologiche vengono condotte operando su colture pure, cioè su singole specie di microrganismi; pertanto tutte le operazioni devono essere condotte in condizioni tali da evitare la contaminazione da parte di ogni altro microrganismo proveniente dall'ambiente esterno, dal materiale di laboratorio e dallo stesso operatore.

E' indispensabile quindi utilizzare esclusivamente materiale sterile: i terreni di coltura devono venire opportunamente sterilizzati in autoclave e mediante filtrazione, mentre le anse di metallo, utilizzate per il trasferimento dei batteri, devono essere sterilizzate portandole all'incandescenza sulla fiamma di un becco Bunsen. Attualmente sono in commercio materiali già sterilizzati, al fine di rendere le operazioni molto più semplici.

Il metodo impiegato per isolare i batteri, in modo da poterne ottenere poi una coltura pura, prevede la semina del campione in esame su di un adatto terreno colturale solido, contenuto in una piastra Petri. Dopo incubazione della piastra a 37°C per circa 24 h , si esaminano le colonie isolate, che possono poi venire trasferite singolarmente in un terreno liquido o solido in modo da ottenere una coltura pura.