RELAZIONE DI CHIMICA DELLE FERMENTAZIONI

Titolo: Determinazione della glicemia nel siero.

Obiettivo: determinare il contenuto di glucosio in un campione di siero campione  mediante il metodo enzimatico colorimetrico con impiego come gromogeno del 4-Amminofenazione e di fenolo.

Principio teorico: il glucosio è un carboidrato, e siccome non può essere idrolizzato in composti più semplici è classificato come un monosaccaride, tutti i monosaccaridi si riducono con i reattivi di Fehling (o di Benedict) o di Tollens e sono quindi noti come zuccheri riducenti.

Il glucosio, formula bruta C H O  è una catena lineare e un aldoesoso, è il monosaccaride più abbondante e importante di qualsiasi altro composto organico, ha un ruolo particolare nei processi biologici: è l'unità fondamentale di cui sono composti la cellulosa (formato grazie alla fotosintesi importantissima per la vita e il sostegno delle piante), l'amido (nutrimento per la crescita di nuove piante immagazzinato nei semi) e il glicogeno.

Il glicogeno viene sintetizzato nel fegato dall'amido assunto per ingestione dal corpo umano, quando occorre viene di nuovo trasformato in glucosio che viene trasportato dal flusso sanguigno nei diversi tessuti dove viene ossidata completamente liberando energia. Un'altra parte di glucosio ingerito viene trasformata in  grassi e un'ultima parte reagisce formando amminoacidi che a loro volta danno le proteine.

Per determinare il tasso di glucosio nel sangue, nel siero, nell'urina e nel plasma si utilizza il test GOD-POD ( noto anche come metodo Trinder) che utilizza 2 enzimi:

il GOD e il POD.

Il GOD è noto come la glucoso-ossidasi e viene estratto dalle muffe Aspergillus Niger, è quindi un'enzima vegetale che ossida in modo specifico il b-D-Glucosio (possibilità stereochimica diversa), con la formazione di acido Gluconico e H O  attraverso l'intermedio D-glucono-lattone che successivamente si idrata spontaneamente formando l'acido.

GLUCOSIO+O +H O ---GOD ACIDO GLUCONICO+H O

Il POD è noto invece come prossidasi e viene estratto dalla pianta dell'Armoracia Rusticana, anch'esso è un'enzima vegetale che aiuta per la determinazione quantitativa del perossido di idrogeno, in quanto quest'ultimo reagisce con il 4-Amminofenazone e il fenolo per formare il 4- (parabenzochinonemonoimmino) fenazone, colorato in rosso la cui intensità di colore è proporzionale alla concentrazione di glucosio.

2H O + 4-AMMINOFENAZONE+FENOLO ---POD 4-FENAZONE +4H O

Per riuscire ad ottenere la quantità di glucosio nel campione applico quindi l'analisi del colore, che richiede una strumentazione tarata sulla sensibilità dell'occhio umano che è in grado di distinguere tre diverse caratteristiche:

la luminosità che dipende dal potere riflettente dell'oggetto colorato ed è associato alla maggiore o minore intensità del colore;

la tinta che è il colore effettivo;

la saturazione che varia secondo la mescolanza di una determinata tinta con il bianco e/o il grigio.

La luminosità è un parametro di tipo quantitativo, mentre tinta e saturazione definiscono il colore in modo qualitativo

La sorgente luminosa ha un ruolo determinante per la definizione del colore e per questo sono stati fissate alcune sorgenti di riferimento, chiamate Illuminanti standard, su cui si basano tutti i moderni strumenti di misura del colore a cui vanno ricondotti tutti i dati sperimentali. Il principale riferimento, noto come ILLUMINANTE C, ha uno spettro di emissione identico a quello della luce "media" diurna.

La legge che serve per calcolare la quantità effettiva è la legge di Beer, la legge che descrive i fenomeni di assorbimento di radiazioni elettromagnetiche.

L'assorbanza (A) è correlata alla frazione di energia radiante assorbita dal campione e perciò è un numero puro. Nella legge di Beer dipende dalla lunghezza d'onda della radiazione, dal solvente e dalla specie chimica che dà l'assorbimento mentre non è strettamente collegata la temperatura.

A=e*b*C

Dove b è il cammino ottico, cioè lo spessore della soluzione attraversata dal raggio, C è la concentrazione della specie che assorbe e e è il coefficiente di assorbimento molare.

Attrezzatura:

3 tubi da saggio

1 pipetta tarata da 5 ml

1 spruzzetta in polietilene per l'acqua distillata

una mirosiringa da 0.05ml

puntali monouso per la microsiringa

Apparecchiature o strumenti:

Spettrofotometro UV- visibile (Genesys2)

Sostanze:

siero campione

soluzione standard di Glucosio 100mg /100ml

kit reagenti(tampone fenolo):

tampone tris-fosfato 180mmol/l, pH 7.8 -fenolo 11mmol/l 3.4-diclorofenolo 2.1mmol/l - etere tra poliglicole e alcool a lunga catena 0.24% -4-amminofenazone 0.8 mmol/l -

strisce di reagenti:

POD=0.9 U/ml e GOD=15 U/ml

Procedimento:

Preparazione del siero di controllo:

- aprire un flacone facendo attenzione a non disperdere il campione liofilizzato, aggiungere con precisione 5 ml di acqua bidistillata.

- Chiudere ermeticamente il flacone e sciogliere il contenuto entro 30 minuti completamente.

- Senza agitare, solo tramite oscillazione, capovolgimento o rotazione, importante: non deve verificarsi la formazione di schiuma. Impiegare il siero di controllo pronto al primo uso allo stesso modo del siero o del sangue.

Preparazione del reattivo Enzimi/Cromogeno:

- immergere una striscia di reagenti (GOD e POD) in un flacone della soluzione tampone più fenolo e mescolare con la stessa il contenuto del flacone per 5-10 secondi.

- lasciar riposare la striscia per 5 minuti nella soluzione, mescolare quindi per altri 10 secondi e eliminare la striscia. Il reattivo preparato risulta stabile per 4 settimane a +2, -8°C e 5 giorni e 15, -25°C.

Determinazione del glucosio:

- prelevare 0.05 ml di soluzione standard di Glucosio 100mg/100ml ed introdurla in un tubo da saggio contrassegnato con S.

- prelevare 0.05 ml di siero campione ed introdurlo in un tubo da saggio segnato con C

- prelevare 0.05 ml di acqua distillata ed introdurla in un tubo da saggio segnato con B

- introdurre quindi in ciascuno dei campioni preparati 5 ml di soluzione di reazione

- mescolare ed incubare al riparo dalla luce diretta a 20-25°C per 30-90 minuti oppure per 15-45 minuti a 37°C.

- misurare quindi l'Assorbanza del siero campione e dello standard contro bianco a 510 nm Spettrofotometro Genesys2.

Calcoli:

Ac

GLUCOSIO mg/dl = ------------ x Cs

As

Ac = Assorbanza campione

As = Assorbanza standard

Cs = Concentrazione standard 100mg/dl

Solitamente i valori normali del glucosio nel sangue si aggirano intorno al 76-110 mg/dl, i valori oltre il 200mg/dl sono considerati sintomo di Diabete.